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创建时间:06-23

核酸酶P1的初步分离纯化

 

1.3  本课题的基本思路
1.3.1  实验的目的
鉴于5′- 磷酸二酯酶的重要性和强大的需求量,如何低成本,高效率生产5′- 磷酸二酯酶成为一个热门的问题。应用桔青霉发酵法生产5′- 磷酸二酯酶的成本低,酶活高越来越受到研究者的青睐。日本首先于1961年将它用于5′- 核苷酸的工业生产,目前国外从核糖核酸生产5′- 核苷酸的工艺大多应用桔青霉的核酸酶P1。通过实验的方法,了解熟悉应用桔青霉制备核酸酶P1的一个过程,同时,试验制备纯核酸酶P1的方法。另外,通过对实验室的熟悉,巩固之前学习过的实验技巧,为国内对5′- 磷酸二酯酶的研究实际工作奠定一定实践基础。
1.3.2  实验流程
采用液体培养的方式,将桔青霉接种至液体培养基中,经过85小时的发酵,滤去菌种,得到粗酶液,在4℃温度下纯化过程,它包括第—次硫酸铵沉淀、热处理、第二次硫酸铵部分沉淀、丙酮沉淀、葡聚糖凝胶G—100层析、冷冻干燥等六个个环节除去一些杂酶,得到较纯的酶,其中,每个环节通过测定酶活力并且进行SDS—PAGE胶分离的方式检验纯化效果及鉴定所得酶液中目标产物的存在。

 

本实验过程历时一个月左右,由以上的实验数据和结果分析可知,该实验方案还是能利用桔青霉发酵生产得到含5′- 磷酸二酯酶的液体,并将5′- 磷酸二酯酶进行个初步纯化。试验过程中:菌种的无菌培养,含目标酶液的保存,丙酮浓度的控制是试验的关键环节。本实验中有冷冻干燥过的样品最后可以检测出活性,同时若要检测酶浓度,又需一系列试验,所以加丙酮的时候,没有个精确的量的把握。因为实验的重心是在酶的纯化结果,以及时间上的限制,所以在这一步上,并没有深入探讨。致使实验没有得到最终的理想结果,这点上,还需要借助更多的参考文献进一步研究讨论。
5′- 核苷酸在医药、食品领域有着重要而广阔的应用前景和作用。而5′- 核苷酸是由5′- 磷酸二酯酶水解核酸而来,微生物发酵法生产5′- 磷酸二酯酶,国内的研究刚刚起步,在发酵条件优化上和纯化步骤上还有许多工作要完善,以便进一步提高产量。本文通过试验,为以后5′- 磷酸二酯酶产业化打下了有利的实践基础。

目录
中文摘要    I
英文摘要    II
目录    III
1.绪论    1
1.1  研究 5′- 磷酸二酯酶的背景和意义    1
1.1.1  5′- 磷酸二酯酶的定义    1
1.1.2   5′- 磷酸二酯酶的作用方式    2
1.1.3   5′-磷酸二酯酶的研究意义和前景    2
1.2  5′- 磷酸二酯酶的制备方法    3
1.2.1  提取法    3
1.2.2  发酵法    4
1.3  本课题的基本思路    4
1.3.1  实验的目的    4
1.3.2  实验流程    5
2.材料和方法    5
2.1 材料:    5
2.2 实验方法    6
2.2.1  菌种的活化    7
2.2.2  发酵培养    7
2.2.3  纯酶制剂的制备    7
2.2.4  酶活力的测定    13
3.结果与讨论    15
3.1 核酸酶P1的发酵    15
3.2 葡聚糖凝胶G-75层析纯化蛋白    15
3.3 各步骤纯化蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳    16
3.4 各步酶纯化试验结果    17
4.结束语    19
致谢    21
参考文献    22

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