核酸酶P1的初步分离纯化
1.3 本课题的基本思路
1.3.1 实验的目的
鉴于5′- 磷酸二酯酶的重要性和强大的需求量,如何低成本,高效率生产5′- 磷酸二酯酶成为一个热门的问题。应用桔青霉发酵法生产5′- 磷酸二酯酶的成本低,酶活高越来越受到研究者的青睐。日本首先于1961年将它用于5′- 核苷酸的工业生产,目前国外从核糖核酸生产5′- 核苷酸的工艺大多应用桔青霉的核酸酶P1。通过实验的方法,了解熟悉应用桔青霉制备核酸酶P1的一个过程,同时,试验制备纯核酸酶P1的方法。另外,通过对实验室的熟悉,巩固之前学习过的实验技巧,为国内对5′- 磷酸二酯酶的研究实际工作奠定一定实践基础。
1.3.2 实验流程
采用液体培养的方式,将桔青霉接种至液体培养基中,经过85小时的发酵,滤去菌种,得到粗酶液,在4℃温度下纯化过程,它包括第—次硫酸铵沉淀、热处理、第二次硫酸铵部分沉淀、丙酮沉淀、葡聚糖凝胶G—100层析、冷冻干燥等六个个环节除去一些杂酶,得到较纯的酶,其中,每个环节通过测定酶活力并且进行SDS—PAGE胶分离的方式检验纯化效果及鉴定所得酶液中目标产物的存在。
本实验过程历时一个月左右,由以上的实验数据和结果分析可知,该实验方案还是能利用桔青霉发酵生产得到含5′- 磷酸二酯酶的液体,并将5′- 磷酸二酯酶进行个初步纯化。试验过程中:菌种的无菌培养,含目标酶液的保存,丙酮浓度的控制是试验的关键环节。本实验中有冷冻干燥过的样品最后可以检测出活性,同时若要检测酶浓度,又需一系列试验,所以加丙酮的时候,没有个精确的量的把握。因为实验的重心是在酶的纯化结果,以及时间上的限制,所以在这一步上,并没有深入探讨。致使实验没有得到最终的理想结果,这点上,还需要借助更多的参考文献进一步研究讨论。
5′- 核苷酸在医药、食品领域有着重要而广阔的应用前景和作用。而5′- 核苷酸是由5′- 磷酸二酯酶水解核酸而来,微生物发酵法生产5′- 磷酸二酯酶,国内的研究刚刚起步,在发酵条件优化上和纯化步骤上还有许多工作要完善,以便进一步提高产量。本文通过试验,为以后5′- 磷酸二酯酶产业化打下了有利的实践基础。
目录
中文摘要 I
英文摘要 II
目录 III
1.绪论 1
1.1 研究 5′- 磷酸二酯酶的背景和意义 1
1.1.1 5′- 磷酸二酯酶的定义 1
1.1.2 5′- 磷酸二酯酶的作用方式 2
1.1.3 5′-磷酸二酯酶的研究意义和前景 2
1.2 5′- 磷酸二酯酶的制备方法 3
1.2.1 提取法 3
1.2.2 发酵法 4
1.3 本课题的基本思路 4
1.3.1 实验的目的 4
1.3.2 实验流程 5
2.材料和方法 5
2.1 材料: 5
2.2 实验方法 6
2.2.1 菌种的活化 7
2.2.2 发酵培养 7
2.2.3 纯酶制剂的制备 7
2.2.4 酶活力的测定 13
3.结果与讨论 15
3.1 核酸酶P1的发酵 15
3.2 葡聚糖凝胶G-75层析纯化蛋白 15
3.3 各步骤纯化蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳 16
3.4 各步酶纯化试验结果 17
4.结束语 19
致谢 21
参考文献 22
- 10-02
- 05-04
- 05-15
- 07-13
- 09-14
- 05-22
- 03-13
- 05-19
- 08-12
- 07-28