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创建时间:10-09

车前子多糖的抗氧化活性研究


  

目  录
中文摘要......................................................................................................................Ⅰ 
英文摘要......................................................................................................................Ⅱ
目录..............................................................................................................................Ⅲ
1 绪论    1
1.1  自由基的认识    1
1.2   自由基的检测方法    3
1.3  抗氧化活性研究的常用模型    3
1.4 车前子的研究概况    4
1.4.1车前子简介    4
1.4.2车前子的化学成分    4
1.4.3药理作用    4
1.4.4应用前景    5
2实验部分    6
2.1实验仪器    6
2.2实验试剂    6
2.3  溶液的配置    7
2.4实验基本原理    9
2.4.1 多糖含量测定原理    9
2.4.2还原能力的测定原理    9
2.4.3  超氧阴离子自由基清除率的测定原理    9
2.4.4羟自由基清除率的测定原理    9
2.4.5  DPPH•清除率的测定原理    10
2.5实验方法    10
2.5.1 多糖含量的测定方法    10
2.5.1.2 样品多糖含量的测定.............................................................10
2.5.1.2 样品多糖含量的测定.............................................................10
2.5.2 还原能力的测定方法    10
2.5.3 超氧阴离子自由基清除率的测定方法    11
2.5.4羟基自由基清除率的测定方法    11
2.5.5 DPPH•清除率的测定方法    12
3实验结果与分析    13
3.1 多糖含量的测定实验    13
3.1.1 标准曲线的制作    13
3.1.2车前子多糖原液中多糖含量测定    13
3.2 还原能力的测定    14
3.2.1 最大吸收波长的确定    14
3.2.2 还原能力的测定    14
3.3 超氧阴离子自由基清除率的测定    15
3.3.1 最大吸收波长的确定    15
3.3.2  超氧阴离子自由基清除率测定    16
3.4 羟基自由基清除率的测定    17
3.4.1 确定最大吸收波长    17
3.4.2 羟基自由基清除率的测定    18
3.5 DPPH•自由基清除率的测定    18
3.5.1DPPH•自由基最大吸收波长的确定    18
3.5.2 清除率的测定    19
4 总结与展望    21
致谢..............................................................................................................................22
参考文献......................................................................................................................23
 
1 绪论
1.1  自由基的认识
二十一世纪是生命科学的世纪。在生命科学的研究领域中自由基生物学是近年来研究得较多,发展得较快的一项新兴学科,它研究生物机体内自由基的产生与清除。自由基与生物个体健康密切相关,对抗自由基攻击(主要是氧化)作用的研究是当今生命科学研究的一个热点。近十余年来,人们逐步揭示了自由基、活性氧以及活性氮在许多生命现象中的重要作用,并进一步运用自由基的基础理论和研究方法,在生物学、医学、以及农林学等众多生命科学领域中取得了一定的科学成就。
自由基是具有不成对电子的原子或分子,其性质不稳定,大多富于反应活性。它的形成主要有共价键龟裂法和电子俘虏法2种方式。前者是指供价化合物龟裂时共用的电子对被双方平均获得,所形成的产物即为自由基,如A:B→A•+B•。后者是指带有成对电子的有机化合物和无机化合物复活了一个电子,就可因带有不成对电子而成为自由基,如O2+e→O2•。体内活性物质代谢异常也可产生自由基,如细胞硫醇和对苯二酚等发生自氧化或者蛋白酶等的催化反应都可引起自由基水平升高。
自由基的种类大体可分为:活性氧及氧自由基,脂类自由基和脂类过氧化物,半醌类自由基三类。
在人体中,细胞在利用氧气过程中会产生自由基,由于其活性较强,一旦形成后即能迅速攻击生物膜的脂类、糖类、蛋白质和细胞内的核酸,其主要危害是导致生物细胞膜发生脂质过氧化,从而引发多种疾病,加速衰老过程。自由基也是机体内不可缺少的活性物质,它可作为第二信使参与细胞信号传递。正常情况下,机体的氧化与抗氧化处于一种动态平衡,但在患病或者衰老等情况下,会出现由于自由基水平升高而导致的病理现象。现代医学的新理论认为不少疾病是人体内过剩的自由基引发的,已知目前与自由基相关的疾病有炎症、心血管疾病、衰老、肿瘤、缺血性疾病、中毒和放射性疾病等。
自由基的清除系统主要可分为大分子酶促自由基清除系统和小分子抗氧化剂及其他自由基清除系统。前者主要是指一些每类物质,包括SOD、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)等。其中SOD广泛存在于各种组织细胞质中,它可歧化O2,形成H2O2。而H2O2在CAT、GSH-Px的作用下分解为H2O,从而达到消除自由基的作用。GSH-Px中的巯基能与活性氧结合,抑制脂质过氧化物的生成从而保护组织细胞。后者主要是指非酶类清除剂,包括维生素A和E,高浓度的抗坏血酸,β-胡萝卜素,尿酸,次氯酸,微量元素Fe、Se、Mn、Cu、Zn等。当脂质过氧化反应链遇到SOD,维生素A、E等抗氧化物后就会终止。有研究还发现,从天然中草药如黄芪、当归、五味子、枸杞、人参、杜仲、茯苓等中可筛选提纯大量抗氧化有效成分。
随着近年来抗氧化剂的蓬勃发展,目前已从单纯的合成抗氧化剂和食品抗氧化剂逐渐发展成为天然抗氧化剂与体内自由基清除剂。各种广泛使用的合成抗氧化剂由于其潜在毒性和致癌作用等逐渐受到人们的排斥,因此从植物中寻找天然、高效、低毒的抗氧化剂成为了目前抗氧化剂发展的一个必然趋势,并且从天然植物中寻找体内自由基消除剂也将是现代医药和保健行业的发展趋势。中药不但有清除自由基的作用,还有抑制自由基生成和提高抗自由基酶类活性的作用。
在自然界中,可以作用于自由基的抗氧化剂范围很广,种类极多。目前,全球已陆续发现许多有价值的天然抗氧化剂。在这方面的研究中,中国的科学家们已经走在世界的前列。他们已经发现并证明了,中国一些特有的食用和药用植物中,含有大量的酚类物质,这些物质的特点是,有着很容易被自由基夺走的电子,而它们在失去电子后就会成为一种对人没有伤害的稳定物质。近年来,研究自由基及其抑制剂、清除剂和动力学机制逐渐成为化学及医学中的一个新方向,受到人们越来越大的关注,并取得不少研究成果。从中草药和食物中研发自由基清除剂是具有中国特色的,一方面,中国具有几千年研究中草药的历史,另一方面,人们越来越信奉天人合一,要从大自然中获取最天然的保护。
上面也提及到,自由基及抗氧化物质在人类健康中起着巨大的作用,因此也越来越受到人们的重视。尽管自由基及抗氧化的意义已得到普遍承认,但中国应用草药几千年,所涉及的草药种类繁多,完全被研究过,并被研究透彻的草药并不多,也正因此,在这方面的研究空间也相对较大。因而,加强自由基及抗氧化分析方法学在中国中草药中的应用就显得非常迫切。
1.2   自由基的检测方法
在自由基研究领域比较常见的方法有:电子自旋共振(electron spin resonance,ESR)与自旋捕获技术、化学发光法(chemiluminescence,CL)、荧光法(fluorescence)、比色法、分光光度法(spectrophotometry)、HPLC法和脉冲辐解技术等。除了以上的几种常用方法以外,还有一些其它方法如:放电流动-共振荧光法、红外光谱法、形态学原位显示法、电镜细胞化学方法等。而在实际应用中,用ESR及高效液相色谱法HPLC等方法测定自由基,所需仪器昂贵,操作也较复杂,一般实验室难以应用。而用分光光度法测自由基,方法简便实用,虽相对于化学发光法和荧光法,分光光度法的灵敏度要差一些,但其仪器普及率高,故分光光度法更易为一般实验室采用(仪器装置见图2)。其测量原理,是利用自由基反应形成有色稳定物质,再加以检测[2]。
 
1.3  抗氧化活性研究的常用模型
1.亚油酸体系中抗氧化能力的检测----硫氰酸铁法
2.二苯代苦肼基(DPPH•)清除能力测定
3.超氧阴离子自由基清除能力测定
4.羟基自由基清除能力测定
5. ABTS自由基清除能力的测定
6.螯合金属离子能力的测定
7.还原能力的测定
8.总抗氧化能力的测定
9.抑制H2O2诱导的小鼠红细胞溶血实验
10.抑制H2O2诱导的小鼠肝匀浆MDA生成实验    
1.4 车前子的研究概况 
1.4.1车前子简介
车前子又名车前实、虾蟆衣子、猪耳朵穗子、凤眼前仁,为车前科植物。主产于黑龙江、辽宁、河北等地。一般夏、秋二季种子成熟时采收果穗,晒干,搓出种子,除去杂质即得。车前子是我国传统中医用药之一,性甘,微寒,归肝、肾、肺、小经,具有清热利尿、渗湿通淋、明目祛痰的功能[3]。
1.4.2车前子的化学成分
车前子中含大量粘液质(多糖类化合物)及车前子酸、胆碱、腺嘌呤、琥珀酸、蛋白质、微量元素等。主要化学成分为:(1)黄酮类化合物,其中主要包括木犀草素、高车前、车前苷等;(2)三萜类化合物,其中主要包括熊果酸、齐墩果酸等;(3)挥发油,其中主要包括2,6-二叔丁基对甲酚和3-叔丁基-4-羟基茴香醚等;(4)多糖类成分——车前子胶,其中含有L-阿拉伯糖(20%)、D-半乳糖(28%)、D-葡萄糖(31%)、及少量木糖和炭藻糖,主要以p-1,4连接为主,2和3位含侧链;其它还含有生物碱、蛋白质、氨基酸、环烯醚苷类化合物如桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、大量脂肪酸、固醇类及酚酸类、微量元素等。经付志红等检测发现车前子中富含Mg、Fe、Al、Zn等元素,尤其是Mg含量高[3]。
1.4.3药理作用
现代药理研究表明:车前子的药理作用为清热、利尿、明目、祛痰。长期以来,人们采用车前子治疗咳嗽,不论寒热、虚实、内伤外伤,均取得较好的疗效。近年来,车前子的药理研究及临床应用有了新的进展:具有抗炎、抗肝毒、抗衣原体、抗衰老、缓泻、降胆固醇等药理作用[4]。国外车前子壳中多糖成分为主的车前多糖泻药,应用历史悠久。欧车前P.lanceolata中的多糖类分子mannose-binding protein可能具有干扰HIV表面,抑制HIV病毒感染淋巴细胞的作用。国内近年来车前子的临床应用主要在治疗慢性气管炎,治疗急、慢性细菌性痢疾,治疗小儿单纯性消化不良,治疗高血压病,治疗颞下颌扰乱症(重症病人效果不佳),治疗青光眼,用于转正胎位,抗炎,利尿等方面[3]。
1.4.4应用前景
车前子无毒,美国食品与药物管理局(FDA)于1982年曾证明“对车前草种皮的利用,在人体摄取的情况下,没有根据证明对人体会产生危害”。因此,车前子种皮可以作为一种良好的食品添加剂。在食品工业应用上具有广阔的发展前景[4]。车前子具有祛痰,镇咳作用,车前煎服,有良好的镇咳作用;具有抗炎作用,临床应用治疗新生儿脐炎有良好疗效;具有抗衰老作用,能明显增加SOD的活性,减少过氧化脂质LPO的生成,延缓衰老的进程;具有缓泻作用可用于老年人、体弱、孕妇便秘者的治疗;具有降眼压作用,临床应用于治疗青光眼;具有降压作用,临床报道车前子可治疗高血压、颅内高压等疾病,配夏枯草、桑寄生、菊花等治疗高血压有显著的疗效,配泽兰、石菖蒲、生甘草、蝉蜕、全蝎等可治疗小儿颅内高压;具有矫正胎位的作用,临床上主要用于治疗胎位不正,《中药大词典》载车前子有兴奋胃肠道及子宫平滑肌的作用。故在医药工业应用上也具有广阔的应用前景。

2实验部分
2.1实验仪器
移液枪                           北京赛多利斯仪器系统有限公司
旋转蒸发仪RE-52C                 巩义市英峪予华仪器厂                                         
TGL-16M高速台式冷冻离心机        湘仪仪器厂                                                 
78HW-1型数显恒温磁力搅拌器       杭州仪表电器有限公司                                       
BS224S型电子天平                 北京赛多利斯仪器系统有限公司                                                                                       
GZX-9070MBE型数显鼓风干燥箱      上海博讯实业有限公司医疗设备厂                                     
TU-1810型紫外可见分光光度计      北京谱析通用仪器有限责任公司                                     
2S2060B型超声仪                  杭州仪表电器有限公司                                   
2.2实验试剂
车前子                             由中药房购买得到                                                     
车前子粗多糖                       于实验室自制得到  
蒽酮                (A.R级)      上海化学试剂采购供应五联化工厂 
浓硫酸              (A.R级)      原巨化集团公司试剂厂
合葡萄糖            (A.R级)      天津市大茂化学试剂厂
十二水合磷酸氢二钾  (A.R级)      西龙化工股份有限公司
磷酸二氢钾          (A.R级)      湖州湖试化学试剂有限公司
铁氰化钾            (A.R级)      温州市化学用料厂
三氯乙酸            (A.R级)      中国江苏•如皋市金陵试剂厂
三氯化铁            (A.R级)      国药集团化学试剂有限公司  
邻苯三酚            (A.R级)      贵州遵义佳宏化工有限公司
七水合硫酸亚铁      (A.R级)      天津市大茂化学试剂厂      
一水合邻菲罗啉      (A.R级)      天津市大茂化学试剂厂 
过氧化氢30%        (A.R级)      杭州高晶精细化工有限公司
无水乙醇            (A.R级)      杭州高晶精细化工有限公司                               
2,2-二苯基-2-苦基肼游离基(DPPH•)   sigma-Aldrich 提供
2.3  溶液的配置
车前子多糖溶液(以下用原液代替)及其稀释液的配置
取车前子30g,先用索氏提取器在石油醚中脱脂1h,然后抽滤弃去滤液,将滤饼挥干,沸水中提取2h,再次抽滤,取滤液,弃去滤渣。重复以上操作5次,合并滤液,配置正丁醇:氯仿为1:4的混合溶剂,将混合溶剂与提取液在超声环境中混匀,静置分层,弃去下层白色乳状液,得到上层提取液(即sevage法脱蛋白)。然后用活性碳脱色。然后再用旋转蒸发仪将提取溶液浓缩至适宜的体积,即为原液。
其稀释液配置:
取原液2mL,置于25mL容量瓶中,用去离子水定容至25mL。
标准葡萄糖梯度溶液的配置:
精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖标准品0.1012g置于100mL容量瓶中,加去离子水溶解并稀释至刻度,配成1.012mg/mL的标准溶液,精确移取此溶液,1、2、3、4、5mL分别置于25mL的容量瓶中,去离子水稀释至刻度,摇匀,配成梯度标准溶液。
蒽酮—硫酸试液的配置
 

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