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创建时间:10-09

磁性纳米固载淀粉酶研究


 
目  录
中文摘要    I
英文摘要    II
目录    III
1. 绪论    1
1.1  酶的固定化    ...1
1.1.1  固定化酶的发展及现状    1
1.1.2  酶的固定化方法    2
1.1.3  固定化酶的载体    3
              1.1.3.1  固定化酶的载体种类    3
1.1.4  固定化酶的应用    4
1.2   磁性纳米固定化酶技术    4
1.2.1  磁性纳米固定化酶的特性    4
1.2.2  磁性纳米固定化酶的优点    5
1.3   本文研究内容    5
2. 实验部分    6
2.1  一般实验条件    6
2.1.1  试剂和溶剂    6
2.1.2  实验仪器    6
2.2  磁性纳米微粒固定化淀粉酶    7
2.2.1  固载技术流程    7
2.2.2  试剂    7
2.2.2.1  pH7.4的磷酸缓冲溶液    7
2.2.3  操作步骤    7
2.3  Bradford法测定淀粉酶的蛋白质含量    9
    2.3.1  原理    9
    2.3.2  试剂    9
        2.3.2.1  考马斯亮蓝G-250试剂    9
        2.3.2.2  标准白蛋白溶液    9
2.3.2.3  样品溶液    9
    2.3.3  实验步骤    9
2.4  淀粉酶的活性测定    10
2.4.1  原理    10
2.4.2  试剂    10
2.4.2.1  底物缓冲液    10
2.4.2.2  碘贮存液    10
2.4.2.3  碘稀释液    10
2.4.3  实验步骤    10
2.4.4  淀粉酶活力计算    11
3. 结果与讨论    12
    3.1  淀粉酶的固载率    12
3.2   固定化酶和游离态酶水解效果的差异    13
3.3  固定化酶贮存稳定性测定    14
4.总结与展望    16
致谢    18
参考文献    19

 
 
1  绪论
酶是一种具有高选择性、催化反应条件温和、无污染等特点的生物催化剂。目前,酶技术已在食品工业、精细化学品工业、手性摧化,医药等行业得到广泛应用。但自由酶稳定性差、易失活、不能重复使用,并且反应后混入产品,纯化困难,且分离和提纯酶以及它们的一次性使用也大大增加了其作为催化剂的成本,使其难以在工业中更为广泛的应用。在此条件下,固定化酶的概念和技术得以提出和发展,并成为近几年酶工程研究的重点[1]。同时如何利用天然高分子载体,对其改性,或利用超临界技术、纳米技术、膜技术等来固定酶,以提高酶的稳定性、利用率等性质的课题,也成为酶工程研究的热点。磁性纳米固载酶技术,就是其中研究的一个方向。
1.1  酶的固定化
酶的固定化,是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内,仍能进行其特有的催化反应,并可回收及重复使用的一类技术。与游离酶相比,固定化酶在保持其高效、专一及温和的酶催化反应特性的同时,还呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续及可控、工艺简便等一系列优点[2]。
1.1.1  固定化酶的发展及现状
固定化酶“Immobilized Enzyme”这个名词是在1971年第一届酶工程会议上被提议确定的。酶的固定化是通过某些方式将酶和载体相结合,使酶被集中或限制,使之在一定空间范围内进行催化反应。固定化酶是在最近40年的时间里发展起来的。60年代以前,关于固定化酶的报道不足10篇。以Katzir-Katchalski 等教授为首的科学家在60年代对酶固定化方法和固定化酶性质进行了大量研究。1969年日本的千烟一郎博士首先将固定化酶应用于工业生产,开创了固定化酶应用的新纪元。70年代以来,酶固定化技术迅猛发展,固定化酶的研究涉及到生物工程、医药工程、食品工程等多个领域。1974年固定化酶首次投入到果葡糖浆的生产中,到1984年几乎所有的果葡糖浆均采用固定化酶生产,产量约600万吨需要2000到3000吨固定化酶,使得用固定化异构酶生产果葡糖浆成为酶工程中规模最大、最为成功的范例。酶的固定化可通过吸附法、离子交换法、交联法、包埋法、共价结合法去实现。酶固定化后,既能保持酶的催化活性又能克服游离酶的一些不足,提高酶分子结构的稳定性;能与反应物分开,有效地控制生产过程;能与产物分开,可省去热处理使酶失活的步骤,简化生产工艺,使食品等产品更好地保持营养成分;固定化酶可在生产中反复连续使用,提高了酶的利用率。然而,酶固定化对载体材料具有很高的要求,如要有良好的机械强度,良好的热稳定性和化学稳定性,良好的抗微生物特性及酶的结合能力等。载体材料的价格还直接影响固定化酶能否真正用到实际生产中。由于难以找到理想的载体材料,再加上酶在固定化过程中不可避免地损失部分活力,甚至当固定方法不得当时会损失绝大部分活力等原因,到目前为止也只有十几种固定化酶应用于生产中。我国的固定化酶研究工作始于70年代初,在这一领域的研究具有相当高的水平,如β-硫酸酯乙砜基苯胺(SESA)是我国首先使用的一种高效双官能团试剂,但我国尚未见商品的固定化酶专用载体。因此近十年来,我国酶学专家与国外专家学者一样把酶固定化技术的研究重点集中于固定化方法和载体材料的开发上,以便找到更简便实用的固定化方法和性能优良的载体[3]。
1.1.2  酶的固定化方法
如今发展起来的固定化方法则有:吸附法、包埋法、共价结合法、交联法等。
⑴ 吸附法是利用离子键、物理吸附等方法,将酶固定在纤维素、琼脂糖等多糖类或多孔玻璃、离子交换树脂等载体上的固定方式。工艺简便及条件温和是其显著特点,其载体选择范围很大,涉及天然或合成的无机、有机高分子材料,吸附过程可同时达到纯化和固定化;酶失活后可重新活化,载体可以再生。国内科研人员选择不同酶,具有很多官能团,可以通过物理吸附、交联、共价偶合等方式将他们固定在磁性微球的表面[1]。
⑵ 包埋法是一种不需要化学修饰酶蛋白的氨基酸残基,反应条件温和,很少改变酶结构的固定化方法。其基本原理是单体和酶溶液混合,再借助引发剂进行聚合反应,将酶固定于载体材料的网格中。固定化时保护剂和稳定剂的存在不影响酶的包埋产率。这种酶包埋在高聚物内的方法对大多数酶、粗酶制剂甚至完整的微生物细胞都适用[1]。
⑶ 共价结合法是酶蛋白分子上功能团和固相支持物表面上的反应基团之间形成化学共价键连接,以固定酶的方法。由于酶与载体间连接牢固,不易发生酶脱落,有良好的稳定性及重复使用性,成为目前研究最为活跃的一类酶固定化方法。其常用载体包括天然高分子(纤维素、琼脂糖、淀粉、葡萄糖凝胶、胶原及衍生物等)、合成高聚物(尼龙、多聚氨基酸、乙烯-顺丁烯二酸酐共聚物等)和无机支持物(多孔玻璃、金属氧化物等) [1]。
⑷ 交联法是用多功能试剂进行酶蛋白之间的交联,是酶分子和多功能试剂之间形成共价键,得到三向的交联网架结构,除了酶分子之间发生交联外,还存在着一定的分子内交联。根据使用条件和添加材料的不同,还能够产生不同物理性质的固定化酶。常用交联试剂有戊二醛、双重氮联苯胺-2, 2′-二磺酸、1, 5-二氟-2, 4-二硝基苯、己二酰亚胺酸二甲酯等[1]。
上述四种酶固定化方法各有其自身的不足之处,因此,有人将几种方法结合使用,取长补短,研究了其固定化效果[4]。例如:曾鸣等[5]在进行固定菊粉酶水解菊芋提取液制备果糖的研究中,将内切菊粉酶和外切菊粉酶,用吸附和共价相结合进行,取得了较好的效果,对果糖、葡萄糖分离,果糖浓度可达95%。无论采用何种方法,固定化酶的稳定性是首要考虑的因素。
1.1.3     固定化酶的载体
1.1.3.1  固定化酶载体的种类
固定化酶载体的种类有:壳聚糖及其衍生物,纤维素及其衍生物,有机合成聚合物,凝胶材料,磁性微球,无机材料,丝素和甲壳素等。
⑴ 壳聚糖及其衍生物  壳聚糖壳聚糖具有良好的生物相容性和易于改性的特点,这使其在酶固定化技术中倍受青睐,研究较早。张所信[1]以中空球形壳聚糖为载体,用戊二醛交联法固定化红酵酶用于L-苯丙氨酸的生产,转化率为82.4%。以壳聚糖为载体,应用交联法或包埋法固定化酶的品种有:木瓜蛋白酶、纤维素酶、胰蛋白酶、糖化酶、凝血酶、α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶等。
⑵ 纤维素及其衍生物  纤维素结构中存在大量的羟基,可通过各种反应,如氧化、酯化、醚化、亲核取代、接枝共聚和交联等,制成多种纤维素衍生物而带有各种活泼基团,可用于酶固定化的研究。
⑶ 有机合成聚合物  可以分为离子聚合物,接枝聚合物,其他有机聚合物
⑷ 凝胶材料  凝胶具有良好的生物相容性,与疏水聚合物相比,同被固定化的酶之间只有弱得多的相互作用,固定在凝胶中的酶活性能够保持较长时间。卡拉胶、聚乙烯醇、海藻酸钙凝胶是应用较早的凝胶材料。
⑸ 磁性微球  磁性微球应用于酶固定化方面具有以下4大优点:①具有磁性,可方便简单地进行分离和磁性导向;②具有很好的生物相容性;③其表面含有大量功能团;④分散性好。磁性微粒除可以利用吸附法固定化酶外,还可以利用共价交联法等其他方法。
⑹ 无机材料  在无机材料作为酶固定化载体的研究中,硅胶具有重要的地位。
⑺ 丝素和甲壳素  丝素和甲壳素用于固定化酶具有生物相容性好、酶活力保持率高、强度高、易于修饰等优点[3]。
酶、载体及试剂的费用、操作难易等与工业化有关的因素也必须考虑。科研人员在研究时,应尽量选用价格低廉、易得的载体和试剂,载体最好是已在其他工业生产中大量使用的材料,同时也要考虑其应用时的安全性。        
1.1.4     固定化酶的应用[6]
⑴ 固定化酶在工业生产中的应用
酶的固定化技术诞生以来,不论是早期从动物脏器和植物种子中提取的酶,还是后来发现的种类繁多、功能多样的微生物酶都已经被覆盖在固定化酶的研究领域中。固定化酶最早是应工业生产的需求而产生的,到目前为止其最大的应用范围还是在工业生产上。其中,固定化葡萄糖异构酶是世界上生产规模最大的一种,它可以用来催化玉米糖浆生产高甜度的高果糖糖浆。
⑵ 固定化酶在生化制药中的应用
固定化酶的另一个巨大市场是用来生产工业、医学等领域的一些纯度要求较高的制剂,这其中有最早生产的氨基酸,还有抗生素、核酸、蛋白质抗体、高纯度的蛋白酶等。科研人员首先于1973年用固定化的青霉素酰化酶生产制造各种半合成的青霉素和头孢霉素。
⑶ 固定化酶在生物传感器和环境保护中的应用
生物传感器是由生物活性物质与换能器组成的分析系统,可以简便、快速地测定各种特异性很强的物质,在临床分析、工业监测等方面有着重要的意义。固定化葡萄糖氧化酶传感器是其中应用最为广泛的一种。
1.2  磁性纳米固定化酶技术
在磁性纳米固定化过程中,难以直接将酶固定化于一些纳米级的磁性金属或金属氧化物(如:铁、钻、镍及其氧化物)。因此,我们可以采用有机-无机纳米复合材料固定化酶。有机-无机纳米复合材料可以同时兼顾有机和无机纳米粒子的优点,其研究近年来引起了人们极大的兴趣。Fe3O4纳米粒子具有顺磁性和低毒性,它在生物及医药方面的应用受到了极大的关注。近年来报道过一些以Fe3O4为核的复合粒子的研究,例如,以高分子化合物为壳的微米级材料来固定酶等生物分;以氨基硅烷-Fe3O4纳米复合粒子固定褶皱假丝酵母脂肪酶(CRL)等[7]。
1.2.1 磁性纳米固定化酶的特性
⑴ 纳米  由于酶的催化效率及选择性在很大程度上取决于所使用酶的比表面积和几何形状;如不考虑其它因素,则粒径越小,比表面积越大,催化剂的效率就越高。传统的固定化酶粒径一般为(0.1~10)mm。由于受到固定酶量少和较大传质阻力的影响,这类固定化酶的催化效率比较有限。而纳米级固定化的酶具有比表面积大、传质阻力小、固定酶量多和催化效率高等优点,这使得酶的纳米级固定化技术受到越来越广泛的关注[2]。
⑵ 磁性  因为具有磁性,可方便简单进行分离和磁性导向,因而在性能上与相同组成微米材料有非常显著差异,体现出许多优异性能和全新功能。
1.2.2  磁性纳米固定化酶的优点
磁性纳米固载酶大致有以下优点:
⑴ 易于将酶与底物和产物分离;
⑵ 可提高酶的生物相容性和免疫活性;
⑶ 能提高酶的稳定性,且操作简单、成本较低;等。
因此,磁性纳米微粒作为载体,在酶固定化领域可望能有广泛应用[3、5]。
1.3  本文研究内容
固定化酶是酶工程的核心内容之一。游离酶一般都溶于水,其本身也不稳定,利用后分离困难,造成浪费。若将酶固定于各种载体上,就可以很方便地分离和重复利用,对提高酶的利用效率,延长使用时间具有重要意义。然而固定化酶的性能取决于固定化酶的固定化方法以及所使用的载体材料的性质[3]。
本文主要是用磁性纳米载体来固定化酶,运用用有机-无机纳米复合材料技术,将纳米级氧化铁和四氧化三铁与氨基硅烷螯合,制成氨基硅烷-Fe3O4纳米复合材料;再以戊二醛作为交联剂,将淀粉酶固载上去,形成固定化酶。计算固定化淀粉酶的固载率,比较固定化酶和自由酶的活性以及比较固定化酶和自由酶的贮存稳定性。

2  实验部分
2.1  一般实验条件
2.1.1  试剂和溶剂
所用的试剂和溶剂,详见表1。
表1 试剂和溶剂
试剂和溶剂    规格    厂家
3-氨丙基三乙氧基硅烷    AR    ACROS ORGANICS
氧化铁    AR    ACROS ORGANICS
四氧化三铁    AR    ACROS ORGANICS
戊二醛(25wt%)    AR    ACROS ORGANICS
氯仿    AR    浙江迪耳药业有限公司
甲醛    AR    衢州巨化试剂有限公司
磷酸氢二钾(K2HPO4•3H2O)    AR    上海山浦化工有限公司
磷酸二氢钾(KH2PO4)    AR    上海山浦化工有限公司
三氯乙酸    AR    江苏如臬市金陵试剂厂
氢氧化钠    AR    杭州化学试剂有限公司
氯化钠    AR    上海试四赫维化工有限公司
无水醋酸钠    AR    温州市化学试剂有限公司
碘化钾    AR    杭州化学试剂有限公司
碳酸钾    AR    宜兴市第二化学试剂厂
冰乙酸    AR    杭州高晶精细化工有限公司
浓盐酸    AR    杭州化学试剂有限公司
淀粉酶        实验室自备
可溶性淀粉        实验室自备
考马斯亮蓝        实验室自备
牛血清蛋白        实验室自备

2.1.2  实验仪器
测吸光度值:采用上海菁华科技仪器有限公司生产的752型紫外可见分光光度计。
100mL三口烧瓶、1000mL容量瓶、500mL容量瓶、100mL容量瓶、100ml烧杯、10ml烧杯、2ml移液管、5ml移液管、10ml移液管、电子天平、密封式恒温可调加热器、球形冷凝管、温度计、500ml量筒、小试管、胶头滴管、永磁铁、布氏漏斗、定性滤纸等。
2.2  磁性纳米微粒固定化淀粉酶
 2.2.1  固载技术流程[9]
 
图1 固载淀粉酶流程
2.2.2  试剂
2.2.2.1  pH 7.4的磷酸缓冲溶液
A液:称取磷酸氢二钾(K2HPO4•3H2O)12.772g,溶于1000ml去离子水。
B液:称取无水磷酸二氢钾(KH2PO4)9.078g,溶于1000ml去离子水。
取A液8ml,B液2ml,充分混匀即成。
2.2.3  操作步骤[10]
  步骤一:形成磁性纳米复合物
用移液管量取10ml氯仿(b.p.61.7℃),加入干燥的100ml的三口烧瓶中,再200mg纳米氧化铁(Fe2O3)或四氧化三铁(Fe3O4),再加入过量的3-氨丙基三乙氧基硅烷(b.p.217℃)约2ml,。在一定温度下,回流12小时,等自然冷却到室温后,用永磁铁将三口烧瓶中的氧化铁(Fe2O3)或四氧化三铁(Fe3O4)聚集,用20ml氯仿洗涤约5次后取出磁性纳米微球。磁性纳米微球需自然风干。  
 
图2 步骤一
步骤二:磁性纳米复合物与戊二醛缩合
在上述干燥了的纳米复合物中,加入3ml磷酸盐缓冲液(pH 7.4,含1ml 25wt%的戊二醛),室温下静置12小时,永磁铁将微球聚集后,用10ml磷酸盐缓冲液洗涤4次。
 
图3 步骤二
步骤三:固定化酶
将上述所得的磁性纳米复合材料置于5ml磷酸盐缓冲液,再加入100mg淀粉酶,放置24小时,之后用永磁铁收集固定化酶,用20ml磷酸盐缓冲液洗涤3次,自然干燥,即得固定化淀粉酶,其中制得固定化酶的上层溶液仍需保留,用于测定蛋白分析。
 
图4 步骤三


2.3     Bradford法测定淀粉酶的蛋白质含量 [8、11]
    2.3.1  原理
考马斯亮蓝G-250是一种染料,在游离状态下呈红色,最大吸收峰在465nm。当它与蛋白质结合后变成深蓝色,最大吸收峰在595nm。蛋白质含量在0~1000μg/ml范围内,蛋白质-染料复合物在595nm处的吸光度与蛋白质含量成正比,用于比色法测定。
蛋白质-染料复合物具有很高的吸光值,因此大大提高了蛋白质测得的灵敏度,最低检出量为1μg范围内,染料与蛋白质结合迅速,大约为2分钟,结合物的颜色在1小时内稳定。所以本法操作简便,快速,灵敏度高,稳定性好,是一种测定蛋白质含量的常用方法。
2.3.2  试剂
2.3.2.1  考马斯亮蓝G-250试剂
称取100mg考马斯亮蓝G-250,溶于50ml95%乙醇中,加入85%(m/v)的磷酸100ml,最后用去离子水定容到1000ml。此溶液可在常温下放置一个月。
2.3.2.2  标准白蛋白溶液:
 

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