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创建时间:10-09

发酵法生产虾青素发酵过程分析与研究

 

目  录
中文摘要    I
英文摘要    II
目录    III
1. 绪论    1
1.1  虾青素的性质    1
1.2  虾青素的来源和制备    1
1.2.1  培养藻类生产虾青素    1
1.2.2  从甲壳类动物中提取虾青素    2
1.2.3  利用真菌生产虾青素    2
1.2.4  人工合成虾青素    2
1.2.5   酵母生产虾青素的优点    3
1.3  虾青素的应用    3
1.3.1  用作着色剂及动物生长的必须的维生素    3
1.3.2  用作化妆品中的抗氧化剂    3
1.3.3  用于保护眼睛    4
1.3.4 其它应用    4
2. 实验部分    5
2.1  实验材料    5
2.1.1  菌种    5
2.1.2  试剂和主要原料    5
2.1.3  主要实验设备    5
2.1.4  主要培养基    5
2.2  实验方法    5
2.2.1  菌种扩大方法    5
2.2.2  种子培养方法    5
III

2.2.3  摇瓶发酵培养方法    5
2.2.4  菌体生物量的测定    6
2.2.3  摇瓶发酵培养方法    6
2.2.4  菌体生物量的测定    6
2.2.5  类胡萝卜素总量的分析    6
2.2.6  发酵残糖的测定    6
2.2.7 葡萄糖标准曲线的制作    6
3. 结果与讨论    7
3.1  发酵液的制备    7
3.2  不同的葡萄糖浓度对细胞干重的影响    7
3.3  不同葡萄糖浓度发酵液的残糖含量    9
3.4  不同葡萄糖浓度发酵液的虾青素产量    11
3.5  葡萄糖添加时间对细胞干重及残糖的影响    12
3.6 添加时间对虾青素产量的影响    14
4.总结与展望    16
4.1  总结    16
4.2  展望    16
致谢    17
参考文献    18
 
 
1.绪论
随着生物技术的快速发展,利用微生物发酵生产功能性食用天然色素成为当前的研究热点。虾青素素是由多个异戊二烯单位构成的含有多个双键的化合物,属于萜烯基团类,是一类目前研究比较多的,具有重要经济实用价值的天然色素。同其他类胡萝卜素一样,虾青素在动物和人体内具有极强的生物活性和重要的生理功能。如作为着色剂用于水产和蛋禽的着色,作为药品或保健品用于保护血管、降低胆固醇、护肤、保护视力、保护神经系统、预防老年痴呆、缓解关节疼痛等,作为化妆品用于防晒和护肤等。
1.1  虾青素的性质 
虾青素(astaxanthin),化学名称为3,3′-二羟基-4,4′-二酮基-β,β′-胡萝卜素,分子式为C40H52O4,相对分子质量为596.86,是一种酮式类胡萝卜素[3],色泽为红色,具脂溶性,不溶于水,易溶于氯仿、丙酮、苯和二硫化碳等有机溶剂,其化学结构是由4个异戊二烯单位以共轭双键型式联结,而两端又有2 个异戊烯单位组成六节环结构组成的,其化学结构如下。
           
                      图1-1 虾青素的结构式
1.2  虾青素的来源和制备
虾青素的来源主要有两种,一种是天然的虾青素,另外一种是人工合成的虾青素。天然的虾青素主要来源于微藻、细菌、原生动物、真菌和甲壳类动物,其中细菌来源中的菌体由于生长慢且含量低,目前被认为无利用价值。由于原生动物自身不能合成虾青素,因此不予考虑。所以,目前认定天然的来源只有三种即微藻,甲壳类动物和真菌。人工合成的虾青素的市场份额较多,但其安全性比天然的虾青素较低,因此,在应用上受到一定的限制。
1.2.1  培养藻类生产虾青素
研究发现在藻类中有不少的种类可以生产虾青素,目前国内外报道最多的是雨生球藻。因为雨生红球藻是虾青素含量最高的微藻, 也是所有已知的虾青素合成生物体中积累量最高的物种, 其积累量最高可达细胞干重的4 %[4]。它在不利的环境条件下会积累一定量的虾青素,国外优良的雨生红球藻体中虾青素一般约占类胡萝卜素总量的90% 以上。除雨生红球藻外, 血红裸藻,莱茵衣藻、小球藻、雪藻等绿藻在不利的环境条件下也会积累一定量的虾青素。但微藻合成虾青素存在如下缺点: 虾青素的积累是逆境胁迫的产物, 在正常的生长条件下没有合成或很少合成,诱导虾青素积累的逆境胁迫与藻细胞生物量积累互相矛盾,而且生长较慢,需要较长的培养周期。
1.2.2  从甲壳类动物中提取虾青素
据报道,国外的虾蟹加工业每年有1000万吨的甲壳类水产品的废弃物。从经济和环保的角度考虑,从水产品加工的废弃物中提取虾青素既能增加经济收益,又有利于减弱废水的色度,减少污染,是一个很好的资源再利用手段的手段。 但这里存在一个必须考虑的问题:甲壳中以灰分和几丁质含量较高,而虾青素的产量则相对较低,这些物质或以游离的形式存在, 或与蛋白质、脂类等结合的形式存在,极大地限制了虾青素的提取和再利用。该法生产虾青素生产条件要求苛刻, 生产成本高,产量较低, 产品纯度也不够高。因此,目前仅有极少数国家采用此方法生产虾青素。
1.2.3  利用真菌生产虾青素
红发夫酵母、深红酵母、粘红酵母等真菌可以合成虾青素。其中,以红发夫酵母中虾青素积累量较高。据报道,该菌种最早由Phaff等人于1970 年在美国的阿拉斯加的高山上和日本北海道一带山区落叶树的渗出液中分离到的[5]。1976 年,Andrews等人[6]首次在法夫酵母中发现虾青素,它是酵母所产的10多种类胡萝卜素中最大的组分,占总类胡萝卜素的40%—95%,因此红发夫酵母被认是除雨生红球藻外最为合适的虾青素来源[7],实践也证明了这一点,因为现在红法夫酵母已成为工业化生产虾青素的优良菌种。
1.2.4  人工合成虾青素
人工合成虾青素不仅价格昂贵,而且同天然虾青素在结构、功能、应用及安全性等方面差别显著。在结构方面,天然虾青素主要是3S,3 S(左旋)构象为主,而人工合成的虾青素为3种构型的混合物,且以3R,3 S(右旋)为主[8] 。且人工合成的虾青素在动物体内无法转化为天然构型;在生理功能方面,天然虾青素的稳定性和抗氧化活性显著地高于人工合成的虾青素;在应用效果上,天然虾青素的生物吸收效果及着色性也优于人工合成的虾青素;在生物安全方面,利用化学手段合成虾青素时将不可避免的引入杂质化合物,如在合成过程中产生的非天然副产物等,降低了人工合成虾青素的生物利用安全性。
1.2.5  酵母菌生产虾青素的优点
虽然微生物来源的类胡萝卜素大多数是胞内产物,我们必须将其从西胞内提取出来,而且微生物合成类胡萝卜素含量很低无法与化学合成的能力相比,但是由于天然的类胡萝卜素作为食品添加剂更加安全,崇尚自然和养殖业的迅速发展,都使微生物来源的类乎萝卜素的倍受关注。利用酵母菌生产虾青素除了有上述优点外,还有一些其它工业微生物无法比拟的优点。如除了营养要求简单粗放、代谢快速、发酵周期短,菌体无毒、营养丰富[9-10]。等特点外,它还能够在发酵罐中实现高密度培养,实现于产业化发展。因此,利用酵母菌生产类胡萝卜素是一项很有发展前景的微生物技术,具有很大的实用价值及开发前景。
1.3  虾青素的应用
1.3.1  作着色剂及动物生长必须的维生素
类胡萝卜素在动物体内有很好的沉积作用,但动物本身又不能合成,所以必须从食物中得到。虾青素是类胡萝卜素合成的终点,进入动物体后可以不经修饰或生化转化而与肌红蛋白非特异性结合直接贮存沉积在组织中。因而,鱼类和甲壳类等动物对虾青素的吸收和积累要比其他类胡萝卜素如叶黄素和玉米黄素等有效得多。有报道指出,在观赏鱼的着色问题上, 目前还没有其他的哪一类物质能像虾青素一样效果显著且持久[11]。除此之外, 虾青素更大的价值其在对鱼蟹和家禽等动物生长繁殖所不可替代的重要作用,作为水产动物必需的维生素,它可作为激素促进鱼卵受精,减少胚胎发育的死亡率,促进个体生长,增加成熟速度[12]。
1.3.2  用作化妆品中的抗氧化剂
虾青素因其独特的分子结构,可以高效的猝灭紫外线引起的自由基,是种很好的自由基清除剂,是自然界中最强的抗氧化维生素, 其抗氧化活性是维生素E 的550倍,具有“超级维生素E”的美誉[13]。 众所周知,紫外线辐射是导致表皮光老化和皮肤癌的重要原因。研究认为:虾青素能够在皮肤受光照时消耗腐胺[14],降低精胺和亚精胺等游离多胺浓度,作为潜在的光保护剂,保护细胞膜和线粒体膜免受氧化损伤,用于阻止皮肤光老化,防止诱发皮肤癌。并且能够最大限度地消除细胞内有害自由基,延缓细胞衰老,减少皮肤皱纹,减少黑色素沉积,减少雀斑产生,保持水分,从而使皮肤更有弹性,张力和润泽感。
1.3.3  用于保护眼睛
导致眼睛失明的是与年龄相关性视斑恶化和白内障,这两种过程都与眼睛的光导氧化有关[15-18],大量摄取类胡萝卜素,特别是叶黄素和玉米黄质,可降低这两种病的发病率,虾青素的结构与叶黄素和玉米黄质非常的相似,但相较于叶黄素和玉米黄质来说,虾青素具有更好的抗氧化性效果。所以虾青素也可以将对眼睛有损伤性的活性氧淬灭,帮助保护视网膜,防止视网膜的氧化和感光器的损伤,且这种能力比叶黄素和玉米黄质等类胡萝卜素都还要强。
1.3.4  其它应用
临床研究表明,低密度脂蛋白(LDL)的氧化是导致动脉硬化的重要原因。而血液中高密度脂蛋白(HDL)则有相反的作用,它可以阻止动脉硬化的发生。动物研究表明,虾青素在体内具有显著升高HDL和降LDL的功效。Tanaka等的研究发现,虾青素可显著抑制化学物诱导的初期癌变,对暴露于致癌物质中的上细胞具有抗增殖作用和强化免疫功能的作用;虾青素还可以作为一种抗氧化剂抑制自由基对机体的氧化损害作用,缓解运动疲劳,增强机体能量代谢。

 
2.实验部分
2.1  实验材料
2.1.1  菌种
红法夫酵母,本实验室保藏
2.1.2  试剂和主要原料
葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、KH2PO4、MgSO4.7H2O、CaCl2.H2O、二甲亚砜、丙酮、DNS试剂
2.1.3  主要实验设备
摇床(太仓市实验设备厂,DHZ-DA型)、超净工作台(苏州净化设备有限公司,SW-CJ-1B型)、生化培养箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂,MJX-250B-Z型)、紫外分光光度计(上海精密科学仪器有限公司,752N型)、电子天平(北京赛多利斯系统有限公司,BS 224S型)、离心机(上海安亭科学仪器厂,TDL-50-B)、灭菌锅(上海博迅实业有限公司医疗设备厂,YXQ-LS-18SL)、烘箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂,GZX-9070MBE)、冰箱、电炉、恒温水浴锅
2.1.4  主要培养基
种子斜面培养基A:葡萄糖10g/L,麦汁3g/L,蛋白胨5g/L,酵母膏3g/L,琼脂20g/L
种子液体培养基B:葡萄糖10g/L,麦汁3g/L,蛋白胨5g/L,酵母膏3g/L,自然PH
发酵基础培养基C:蛋白胨5g/L,KH2PO4 1g/L,MgSO4•7H2O 0.5g/L,CaCl2•H2O 0.1g/L,酵母膏2g/L,自然pH 
2.2  实验方法
2.2.1  菌种扩大方法
将保藏的菌种无菌操作接种到多支试管的培养基A上,22℃培养3天,将培养好的菌种保藏在冰箱中。
2.2.2  种子培养方法
 

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