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创建时间:04-06

γ-氨基丁酸的发酵法生产和检测


Fermentation production and detection of gamma-aminobutyricacid

目录
中文摘要    I
英文摘要    II
目录    III
1.绪论    1
2.γ-氨基丁酸的发酵生产工艺    3
2.1发酵流程    3
2.2酶解流程    4
3.γ-氨基丁酸生产过程的质量控制    5
3.1质量控制的主要检测指标及方法    5
3.1.1 镜检    5
3.1.2测定培养液的OD值    6
3.1.3测定培养液和样品的pH值    6
3.1.4 测定产品γ-氨基丁酸的含量    6
3.1.4.1 HPLC检测条件    7
3.1.4.2样品预处理    7
3.1.4.3标准曲线制备    7
3.1.4.4 γ-氨基丁酸含量计算公式    7
3.2结果与讨论    7
3.2.1发酵过程的质量控制    7
3.2.2酶解过程的质量控制    8
4.γ-氨基丁酸的市场发展展望和存在问题分析    11
致谢    14
参考文献    14


1.绪论
γ-氨基丁酸简称GABA,NH2CH2CH2CH2COOH,C4H9NO2,分子量103.12,是一种广泛分布于动植物、微生物体内的非蛋白质氨基酸,是由谷氨酸经过谷氨酸脱羧酶催化转化而来的。在植物中,如豆属、参属、中草药等的种子、根茎和组织液中都含有γ-氨基丁酸[1-2]。在动物体内,γ-氨基丁酸仅存在于神经组织中,如在金鱼视网膜中,突触传递功能的作用[3],其中脑组织中的含量在0.1~0.6 mg/g组织[4]。1950年,Florey与Ronert在哺乳动物脑萃取液中首先发现γ-氨基丁酸。现今医学上已证明γ-氨基丁酸是中枢神经系统的抑制性递质,是脑组织中最重要的神经递质之一,降低神经元活性,抑制焦虑信息传入脑中枢,镇静神经而抗抑焦虑。γ-氨基丁酸它参与多种代谢活动,具有很高的生理活性。介导40%以上的抑制性神经传导,参与脑循环生理活动,具有抗心律失常功能,具有降血压,抗惊厥,镇痛,改善脑机能,精神安定,促进长期记忆,γ-氨基丁酸可作为少年儿童智力的营养补充剂和促进剂。促进生长激素分泌,肾功能活化,肝功能活化,抗疲劳等生理功能。最新研究表明,除具有上述生理作用外,还有调节激素分泌,改善更年期综合症促进酒精代谢和消臭效果以及高效减肥[5]。
富含γ-氨基丁酸食品的开发始于1986年,当时日本农林水产茶叶实验研究首先开发成功了富含γ-氨基丁酸的茶,并制成商品销售,1994年,Takayo等在研究用水浸泡的米胚芽的氨基酸分布时,发现经过发酵处理的米胚芽中的γ-氨基丁酸积累量很高,达到201 - 300 mg/100 g。1996年,富含γ-氨基丁酸的米胚芽制品在日本实现了商业化。神经生理及神经医学的研究表明,γ-氨基丁酸是一种重要的活性物质,在人脑中,虽然γ-氨基丁酸可由脑部的谷氨酸在专一性较强的谷氨酸脱羧酶作用下转化而成,但是年龄的增长和精神压力的加大使γ-氨基丁酸的积累异常困难,而通过日常饮食补充可有效改养这种状况,从而促进人体健康[6]。因此,γ-氨基丁酸成为一种新型的功能食品配料,在日本被广泛地应用于饮料、果酱、糕点、饼干、调味料等制品中。
目前,γ-氨基丁酸(GABA)的制备方法大致可分为化学合成、分离提取或富集和生物合成3大类,但均存在不足之处。其中化学合成法中,文献报道[7]主要有通过脱硫反应、氨化水解反应、丁酮酸还原的方法等。脱硫反应方法所用原料蛋氨酸衍生物及催化剂价格昂贵,且其所用脱硫剂难得,生产成本较高,工业生产不易采用。氨化水解反应方法中需使用剧毒品氰氢酸或氰氢酸盐,环境污染大,氨基氰水解后分离比较困难。且氨解反应条件苛刻,特别是D,L-α-氨基丁酸与副产物分离比较复杂,稍有不当即影响产品质量,工业中不常用此法。丁酮酸还原法反应采用的原料丁酮酸不易得到。且氢化反应对反应设备要求高,操作难度大。α-卤代酸的氨解法使用的溴素成本较高,副产品对环境污染较大。还有一种化学合成方法[8]有原料易得、路线短、操作方便、收率高、成本低的特点,适合大工业生产。此方法的合成路线:
 
NH3
ClCH2CH2COOCH3                   NH2CH2CH2CH2COOCH3
                   NaOH     
NH2CH2CH2CH2COONa
HCl
NH2CH2CH2CH2COOH                         
该方法将氯化反应和酯化反应同时进行。将丁内酯及氯化亚砜投入反应器。在常温搅拌下滴加甲醇。然后在50~60℃加热反应4h。用饱和NaHCO3溶液中和。分层,油相用无水Na2SO4干燥,减压蒸馏得4-氯丁酸甲酯。第二步反应先进行氨解。即氨基取代氯基反应,然后在碱性条件下水解。使酯基在碱性条件下皂化成钠盐,再用盐酸调pH值,溶液浓缩去盐分离后得γ-氨基丁酸粗品,用水醇溶液重结晶,得γ-氨基丁酸无色晶体粉末。
其中分离提取方法生产γ-氨基丁酸是以天然产物或天然产物经过加工后的副产物为原料,经过提取、分离、提纯制得,生产工艺安全,但成本较高。其中从米糠中提取γ-氨基丁酸的实验[9]报道的比较多,工艺流程大致为:
菌种→活化

米糠脱脂→抽提→接种发酵→过滤→真空浓缩→冷冻→干燥→成品

    茶叶中γ-氨基丁酸的富集的研究也很多,目前主要的富集措施有:茶树叶面喷施处理、嫌气厌氧处理、微波及红外线照射处理和浸渍处理等[10]。
生物合成方法是通过微生物发酵和酶解获得γ-氨基丁酸,以谷氨酸或其衍生物(谷氨酸钠,或富含谷氨酸的物质等)为原料,利用酵母菌、乳酸菌和曲霉菌等食品安全级微生物发酵制得。具有操作条件温和、成本低、含量高及可安全用于食品的优点,但投入大、发酵周期长、高效的微生物菌种通常较难获得,因此工业化难度大。代谢条件受如下因素制约:pH值、辅酶、抑制剂、温度、含氧量、水分以及中间补料等等。主要反应方程式:
                       谷氨酸脱羧酶
HOOC-CHCH2CH2COOH                 NH2CH2CH2CH2COOH+CO2

NH2

2.γ-氨基丁酸的发酵生产工艺
生物合成方法是通过微生物发酵和酶解获得γ-氨基丁酸,以谷氨酸为原料,利用食品安全级微生物发酵发酵制得。主要分2个工艺流程,发酵流程和酶解流程。发酵过程又可以分为在实验室和在生产车间2个阶段。而酶解过程都是在生产车间完成的。
2.1发酵流程
菌种活化  →  扩大培养  →  放罐  →  过滤  →  菌种保存


图1  γ-氨基丁酸的发酵流程
菌种活化前的准备工作:配制培养基,将培养基倒入2个平板、20个试管、5个锥形瓶中,再用一个锥形瓶装抗生素。然后将平板、试管、摇瓶、移液枪以及枪头和抗生素用报纸包好放入高压蒸汽灭菌锅中灭菌,灭好菌后放入超净台中备用。
菌种活化:先将超净台紫外灭菌半小时,然后在超净台中,把冷藏在冰箱的菌种接种到灭菌的平板培养基中,

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