HPLC法测定水产品中阿苯达唑及其主要代谢物残留的研究

目  录
中文摘要    I
英文摘要    II
目录    III
1. 绪论    1
1.1  前言    1
1.1.1 阿苯达唑及其代谢物的理化性质    1
1.1.2 阿苯达唑的作用机理和使用背景及其主要代谢物的危害    2
1.2 阿苯达唑及其主要代谢物检测技术的国内外发展现状    2
     1.2.1 阿苯达唑残留检测的特点    2
     1.2.2 前处理的一般方法和新型方法的比较    3
1.2.3 国内外检测阿苯达唑药物的方法分析探究    4
2. 实验部分    5
2.1  试剂和材料    5
2.2  仪器设备    5
2.3  实验操作方法    6
2.3.1 色谱条件    6
2.3.2 标准储备液的配制及标准工作液的配制    6
2.3.3 标准曲线的绘制    6
2.3.4 确定最低检测限和定量限    6    
2.3.5 组织样品的准备    6
2.3.6 预处理的操作方法    6
2.3.7 色谱分析方法    7
3. 结果与讨论    8
3.1   样品前处理条件的选择    8
3.1.1 提取剂的选择    8
3.1.2 净化脱脂剂的选择    8
3.2   色谱条件的选择    8
3.2.1 流动相的选择及比例调整    8
    3.2.2 定容标准品流动相的选择    10
    2.2.3 流速的选择    13
    3.2.4 柱温的选择    13
    3.2.5 检测波长的选择    13
3.3   精密度和准确度    14
3.4   方法的灵敏度和检测限    19
4．总结与展望    20

致谢    21
参考文献    22
附录    

1  绪论
1.1 前言
目前人们不仅对生活质量的要求在日益提高，食品安全的关注度更是加大了，然而经2019年石家庄三鹿集团生产的婴幼儿配方奶粉受三聚氰胺污染的事件和蒙牛特仑苏OMP奶事件的影响，社会各界对食品质量安全和各方面相关的检测都更加注重起来，国内外对进出口的食品安全检测检疫要求也更加严格了。
为加强兽药残留监控工作，保证动物性食品卫生安全，我国2013年发布的《动物性食品中兽药最高残留限量》第235号公告中规定阿苯达唑的总残留量，肌肉为100μg/kg、脂肪中为100μg/kg，肝脏为5000μg/kg、肾脏为5000μg/kg，奶中为100μg/kg，对动物源食品中苯并咪唑类兽药残留量检测和监控，已列入《中国动物源食品残留监控计划》【1-3】，以确保我国动物源食品的安全。我国以及联合国粮农组织、欧盟、美、日等国都将苯并咪唑类药物列入限制使用的兽药药物中，并制定出各种苯并咪唑类药物在不同动物体内(包括肌肉组织，奶制品等)的最高残留限制量，建立一种快速、准确和高效的检测分析方法，不但起到维护公众健康的作用，还将大力推动无公害食品水产品养殖基地的建设，与国际标准相接轨，能有效增强我国水产品在国际市场的竞争力：它已经成为提高水产品安全性和促进国际贸易的必要条件，也为我们社会生活的基本质量提高一大截。
1.1.1  阿苯达唑的理化性质
阿苯达唑(Albendazole，ABZ)又称丙硫咪唑，属苯丙咪唑类药物。具有广谱、高效、低毒等特点。其化学名：[5-(丙硫基)-1H-苯并咪唑-2-基]氨基甲酸甲酯，分子式 C12H15N3O2S，分子量 265.3294，其固体为白色或类白色粉末；无臭，无味。阿苯达唑结构式见如图1。它的溶解性质为不溶于水，而在丙酮或氯仿中微溶，易于溶解在冰醋酸中 [4]。阿苯达唑对酸、碱、高温、强光等较为稳定[5]，易被氧化。在酸性条件下，其呈质子化状态，在弱碱性条件下，呈游离分子状态[6]。
 
图1 阿苯达唑(Albendazole)结构式
阿苯达唑亚砜（ABZSO）：分子式 C12H15N3O3S，分子量 281.3294；
1.1.2  阿苯达唑的作用机理和使用背景及其主要代谢物的危害
阿苯达唑具有广谱驱虫性质，是人畜共用药，用以驱除动物及鱼体消化道的寄生虫。在体内代谢为亚砜类或砜类后，抑制寄生虫对葡萄糖的吸收，导致虫体糖原耗竭，或抑制延胡索酸还原酶系统，阻碍ATP的产生，使寄生虫无法存活和繁殖。
1977年作为驱虫新药首次用于临床.在此之前,阿苯达唑已作为家畜用驱虫药在狗、猫、牛、羊等动物中使用. 阿苯达唑进入人体, 通过肝脏微粒酶的作用产生它的主要活性代谢产物阿苯达唑亚砜(Albendazole Sulfoxide, ABZSO)，这种代谢产物进一步代谢为阿苯达唑砜( albendazole Sulfone, ABZSO2) 【7-11】。ABZ的杀虫活性主要来源于ABZSO，而ABZSO2 不具有任何杀虫活性，所以阿苯哒唑亚砜的杀虫活性优于阿苯达唑。2017年10月10日，我国允许并通过GMP认证的兽药生产企业生产和在水产养殖过程中使用的国家标准渔药制剂共179个，其中包括阿苯达唑在内的杀虫驱虫类药物24种。
由于阿苯达唑的代谢物可残留在动物体内，人食用后会发生蓄积中毒，严重者会出现人体细胞染色体变异和孕期胎儿畸形，经常食用羊肉和牛杂碎【12-14】的人群易蓄积中毒，存在潜在危害。因此目前是动物性食品兽药残留的重要监控对象。
本研究将建立在阿苯达唑及其代谢产物砜和亚砜【15-16】在水产品中的HPLC测
定方法，可为鱼、虾、鳖、贝类的药物残留检测提供参考。
1.2 阿苯达唑及其主要代谢物检测技术的国内外发展现状
1.2.1阿苯达唑及其主要代谢物检测的特点
水产品中药物残留的检测，都有其共同特点：一是生物组织样中的药物残留量一般比较低，即使是阳性样品，残留量也是很低的，因而对检测方法的灵敏度要求很高；二是生物组织样品成分更为复杂，容易引起干扰的成分较多，使阿苯达唑及其代谢物从生物样中提取出来较为困难，因而对检测方法的选择性要求更高，从提取净化条件和色谱检测条件的选择上要求也很高，因此列举以下前处理及检测方法作为参考和创新。
1.2.2 前处理的一般方法和新型方法的比较
组织样品前处理通常包括样品提取和净化两大部分，提取和净化是息息相关，密不可分的，下面列举一些常用的提取和净化的方法：
液－液萃取：液－液萃取是最早也是最常用使用的一种提取净化方法。现有的国家药残检测标准方法中，大多数用此法作为净化手段。其步骤是将样液用互不相溶的有机试剂萃取，有机试剂回收后蒸发浓缩；也可配合过柱净化增加效果[17]。它的主要优点是操作方便，该方法不需要昂贵的仪器设备和试剂。它的缺点在于易于出现乳化现象、分离时影响回收率，特异性较差，已逐步被其他一些方法取代。
快速溶剂萃取法（ASE）：快速溶剂萃取法，是通过氮气对萃取池中的生物样品加压，再经过点加热，萃取剂在萃取池当中混合溶解待检测目标物，这样的萃取效率效率会大大增加，而却处理简单，编制一个萃取程序，电脑系统将会纪录并自动执行萃取程序，它的优点是萃取效率高，重复性好。萃取残渣与萃取剂直接分离，不需要过滤，快速，科在线净化等；但同时也存在缺点：萃取之后目标物与其他杂质均被萃取出来，如果没有经过充分的净化步骤，在HPLC检测中，可能会导致目标峰与杂质峰会有重叠及覆盖的情况，因此净化也是很关键的。
固相萃取法：固相萃取[19]（SPE）他的优点是可使萃取富集、净化一步完成。SPE的原理是根据物质极性的不同，选择一定极性的填料，将待分析样品过柱，使物质选择性地吸附于填料上，然后进行洗脱，达到分离净化的目的。SPE的主要缺点是柱子的费用较高，柱子是一次性的，回收再现性比较差，而且柱子的批次不同可能造成回收率的波动[20]。
超声波萃取(Supersonic Extraction)：超声波在萃取过程中产生的冲击波对样品直接反复高频冲击，样品表面吸附松懈，超声波产生的冲击力能起到一定的搅拌作用，使样品表面能不断与新鲜的溶剂接触，加速农药在提取液中的溶解，同时使用一定的温度，更是加快了农产品残留农药的扩散速度。该方法实际使用效果良好，大大缩短了分析测试的时间，加快了分析的速度[21-23]。
超临界流体萃取(SFE)：超临界流体本质上是处于临界温度以上的高密度气体，它的特点是气体的粘度小、扩散速度快、渗透力强，又具有液体对样品溶解性能好，可在较低温度下操作，选择性好，前处理简单，分离时间短，完全避免了有机溶剂的使用；他的缺点实验条件的选择和优化比较困难，萃取体系的可选择性差，仪器价格昂贵[23-24]。
对各种阿苯达唑及其主要代谢物的参考文献综合看，还有基于实验室的基本配置条件，还有阿苯达唑及其主要代谢物的药物特性，我们选取液-液萃取作为最主要的提取净化手段。其中通过参考一些常用的前处理方法，并且尝试用ASE快速溶剂萃取及固相萃取SPE技术进行探究，优化色谱条件，摸索一个新的检测方法。
1.2.3 国内外检测阿苯达唑药物的方法分析探究
目前在苯并咪唑类药物分析中所用到的检测方法主要有：（1）分光光度法[25-26]，此法多用于液体样品的检测分析，样品无需事先分离就能消除共有组分的干扰，测定快速简便，应用较广。（2）分子生物学法[27]，特点是特异性好准确率和灵敏度很高，多用于实时药物在体内吸收、转化和排泄的代谢情况，目前在定性分析和样品初筛选中应用最多。（3）色谱法：如薄层色谱法[25]、高效液相色谱法（HPLC）[26～29]和新兴的色谱－质谱联用法[29]，其除了具有前两类方法的优点外，还具有结果准确、重现性好等特点。下面做一下简单介绍：
薄层色谱法(TLC)：以固体吸附剂(如硅胶、氧化铝等)为担体，水为固定相溶剂，流动相一般为有机溶剂所组合的分配型层析分离分析方法。薄层色谱法不需要特殊设备和试剂，方法简单，直观，灵活，但是灵敏度不高[28]，需要与其他技术的联用。
液—质联用法：液相色谱适用于有机物的分析，但在定性方面比较困难，而质谱适合定性分析，把色谱仪和质谱仪结合起来，可发挥二者的优点。质谱检测器(MS)的应用为液相检测技术的发展开辟了新天地——色谱质谱联用技术[29]，它与其他检测器相比，它的特点灵敏度高、检测限低、选择性好和抗干扰。但质谱检测分析也有设备复杂昂贵，维护修理困难，检测成本偏高等缺点，这使得它的应用范围受到较大的限制[30]。
高效液相色谱法技术应用最为广泛。高效液相法中可分离的样品范围广，而且样品前处理更为方便。高效液相色谱法也是分析阿苯达唑及其主要代谢物的主要手段，而且高效液相色谱法操作简便易行，在一般实验室均能进行，加上前处理步骤较简单，净化效果好，方法的准确度和检测限等技术指标完全能满足药物残留分析的要求，适用于目前我国的实验室实际装备情况，这使得高效液相色谱法就成为当前药残检测领域中的主要技术。
而对阿苯达唑及其主要代谢物的检测，主要还是在高效液相色谱及质谱联用法的应用上较为广泛，如曾振灵等报道了猪血清中ABZ及其主要代谢物的HPLC检测方法，邱银生等报道了羊血清中ABZ及其主要代谢物的HPLC检测方法，如张素霞等牛肝中苯并咪唑类药物残留的高效液相色谱检测方法等，但水产品组织及饲料中对ABZ、ABZSO、ABZSO2残留检测的方法的报道还是很少，因此此次对水产品中阿苯达唑及其主要代谢物的HPLC检测方法的探究是很有必要的。
.2 实验部分
2.1 试剂和材料
阿苯达唑（ABZ）标准品
阿苯达唑砜（ABZSO）标准品
阿苯达唑亚砜（ABZSO2）标准品
甲醇为色谱纯
乙腈为色谱纯
冰乙酸为色谱纯
乙酸乙酯为分析纯
水为超纯水
正已烷为分析纯
1mol/L磷酸缓冲液: 称取13.6g磷酸二氢钾，纯水溶解，定容成100ml。
2mol/L碳酸钠溶液：称取碳酸钠固体21.2g溶解，定容于100mL。
2.2 仪器设备
Agilent-1100液相色谱仪（配紫外或二极管阵列检测器，美国Ageilient公司）
ZORBAX-SB C18柱(250×4.6mm)
BL610型电子分析天平（赛多利斯 德国）
Milli-Q超纯水机（美国Millipoer公司）
TDL-5A型台式离心机（上海菲恰尔分析仪器有限公司）
BS210S型电子分析天平（赛多利斯 德国）
旋涡振荡器（华利达：WH-866）
SHZ－82型 恒温振荡器 （浙江金华富华仪器有限公司）
N-EVPA 111型  氮吹仪 （美国Organomation公司）
2.3 实验方法
2.3.1色谱条件
色谱柱为ZORBAX-SB 5um C18柱；流动相为酸化乙腈：水(25:75；v/v)；甲醇-磷酸缓冲液（75︰25；v/v）；流速为1.0mL/min；柱温为30℃；检测波长295.4nm；进样体积为20uL；检测器为DAD二级阵列管检测器。
2.3.2标准储备液的配制及标准工作液的配制
分别精确称取阿苯达唑、阿苯达唑砜、阿苯达唑亚砜0.010g，混合甲醇定溶到100ml容量瓶，制成100μg/ml储备液；再采用倍比稀释方法，用流动相将其配制成0.1、0.5、1.0、5.0、10.0μg/ml的系列标准液，现配现用。
2.3.3