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创建时间:04-06

丙酮酸高产菌株的选育

目  录
中文摘要    I
英文摘要    II
目录    III
1. 绪论    1
1.1 丙酮酸简介    1
1.2 丙酮酸应用    1
1.2.1 丙酮酸在医药方面的应用     1
1.2.2 丙酮酸在农药方面的应用    2
1.2.3 丙酮酸在化妆品行业中的应用    2
1.3 丙酮酸的生产方法    3
1.3.1 化学合成法    3
1.3.2 微生物发酵法    4
1.4 丙酮酸的代谢途径及高产菌株选育的原理    4
1.4.1 代谢途径    4
1.4.2 丙酮酸高产菌株选育的原理    5
2. 实验部分    6
2.1 实验材料    6
2.1.1 出发菌株    6
2.1.2 主要仪器设备     6
2.1.3 培养基    6
2.2 耐酸性实验    7
2.2.1 实验准备    7
2.2.2 实验方法    7
2.3 诱变方法    7
2.3.1 紫外-EMS(甲基磺酸乙酯)联合诱变    7
2.3.2 加热诱变    9
2.2.3 紫外-NTG(亚硝基胍)联合诱变    9
2.2.4 DES(硫酸二乙酯)诱变    10
2.4 筛选方法    11
2.4.1 TTC加层平板法    11
2.4.2 CM,MM平板法    12
2.5 发酵液中丙酮酸含量的测定    12
2.5.1 2,4-二硝基苯肼法(DNS法)    12
2.5.2 硝酸铁法    13
2.5.3 液相色谱法(HPLC法)    13
3. 结果与讨论    14
3.1 耐酸性实验结果    14
3.2 筛选结果    16
3.2.1 TTC加层平板法筛选结果    16
3.2.2 CM,MM平板法筛选结果    16
3.3 丙酮酸含量测定结果    17
3.3.1 2,4-二硝基苯肼法(DNS法)    17
3.3.2 硝酸铁法    18
3.2.3 液相色谱法(HPLC法)    19
4.总结与展望    22
4.1 总结    22
4.2 展望    23
致谢    24
参考文献    25

1  绪论
1.1  丙酮酸简介
丙酮酸(Pyruvic acid),又称 2-氧代丙酸(2-oxopropanoic acid)、α-酮基丙酸(α-ketopropionic acid)或乙酰基甲酸(Acetylformic acid),为无色至淡黄色液体,呈醋酸香气和愉快酸味,见光色变深,易吸潮、聚合、分解,能与水、乙醇、乙醚混溶。其熔点11.8℃,沸点165℃(分解)。分子式C3H4O3,分子量为 85.06,是最重要的α-氧代羧酸之一。
丙酮酸在生物能量代谢中具有十分重要的作用,在无氧分解下有各种变化形式,如肌肉产生乳酸、酵母的酒精发酵和植物组织在无氧状态下生成乳酸或乙醇等,而所有形成丙酮酸的反应途径是完全相同的,并且在有氧状态下分解,通过三羧酸循环被完全氧化。可以认为这是获得能量最有效的途径。在这个意义上,丙酮酸位于无氧分解和有氧分解的交界点上,是极为重要的中间产物。
1.2  丙酮酸应用
丙酮酸是多种化合物合成的前体,被广泛应用于医药,农药,化妆品等行业中。
1.2.1  丙酮酸在医药方面的应用
丙酮酸系列产品是一种重要的药物合成中间体,在药物合成方面应用十分广泛。主要用途如下:
(1)合成治疗高血压的药物 
当前,引起人类死亡的第一号疾病当属心脑血管疾病,而引起这类疾病的最危险的因素便是高血压。为了治疗高血压,医药工作者已发明了许许多多的阵压药物,例如合成萘磺胺来治疗高血压,,但由于这类化合物副作用较大,因两在一定范围内限制了它们的使用。近年来,人们发现人体内有一种称之为“血管紧张素-2”的物质能使血压升高,科学家们从丙酮酸钠出发,合成了一种称之为“血管紧张肽Ⅱ抗药”的化台物,该化合物能有效地抑制“血管紧张素-2”的形成,从而达到降低高血压的目的。
(2) 蛋白酶抑制剂
许多文献报道了从丙酮酸乙酯出发台成系列蛋白酶抑制剂,例如:制备胰肽酶E抑制剂,制备人类白细胞弹性蛋白酶抑制剂,以及合成作为治疗艾滋病的抗HIV感染的病毒蛋白酶抑制剂等等。
(3) 抗病毒剂
从丙酮酸乙酯出发合成系列抗病毒剂有很多文献报道,例如:合成抗病毒的氮杂喹喔啉;合成唾唑啉衍生物作为抗细小核糖核酸的病毒剂。
(4) 镇静剂
    从丙酮酸出发可以合成系列具有抗焦虑、抗惊厥功能的使肌肉松弛的镇静剂,可以用来治疗忧郁症。除此以外.丙酮酸系列化台物还可用于台成治疗肿瘤、溃疡、骨质疏松等疾病的药物,特别值得注意的是,丙酮酸钙是目前销售火爆的减肥药的主要成份之一。
1.2.2    丙酮酸在农药方面的应用
丙酮酸乙酯在构成杂环化台物方面性能优越,是农药台成中难以替代的原料和中间体,它被广泛应用于杀菌剂和除草剂的合成。
(1) 杀菌剂
溴代丙酮酸乙酯是高效杀菌剂噻菌灵的主要中间体。噻菌灵是一种高效、广谱的内吸性杀菌剂,对植物有保护和治疗作用,还可以控制仓储水果、蔬菜的病害,延长保鲜期。
由丙酮酸乙酯合成的噁唑酮衍生物也是一种很好的杀菌剂,在质量份数5.0×l0-4的浓度下即可有效抑制、杀死真菌。
(2) 除草剂
1996年,国外科学家从丙酮酸出发合成了一种高效的除草剂,该除草剂选择性优良,对莎草、狗尾草等杂草除去效果良好,而对农作物则很安全。
1.2.3    丙酮酸在化妆品行业中的应用
(1) 增白剂
在化妆品中添加丙酮酸乙酯,对于增白皮肤,抑制表皮黑点(黑色素)的形成,尤其是抑制表皮中酪氨酸酶的形成有独特的效果。
(2) 防腐剂,抗氧化剂
由于化妆品大多是含碳和氮的化台物,又含有足够的水分,因而非常适宜于细菌和微生物的生存和繁殖,我们选用丙酮酸系列化台物作为防腐剂、抗氧剂添加到化妆品中,能有效地阻止化妆品中易酸败的物质吸收氧,使其不易变质[2]。
1.3    丙酮酸的生产方法
目前国内外生产丙酮酸的方法主要可分为两大类,一是化学合成法,另一种是生物发酵法。
1.3.1  化学合成法
化学合成法又可分为:酒石酸法,电化学法,乳酸直接催化氧化法,丙酮法等。
(1)     酒石酸法
其主要方法为:将酒石酸与焦硫酸钾或硫酸氢钾充分拌匀后,投入搪玻璃反应锅里,用油浴加热至180℃左右,固体开始熔融,并有大量气泡上升,开动搅拌器,打散泡沫,防止溢出,再升温至220℃,即有丙酮酸蒸出,再将馏出物减压蒸馏,收集75-80℃/3825Pa馏分,即得到产品丙酮酸,产率可达到50~55%。这是常规的较为传统的生产方法。此法既费工时,又浪费原料,而且设备损耗大,环境污染严重,大量制备仍是得不偿失[1]。
(2)     电位化学法
从乳酸(盐)制丙酮酸(盐)亦可采用电化学方法,在铅吸附原子改性的铂电极上可将乳酸盐氧化成丙酮酸盐。低电势的影响使得铅沉积在氧化乳酸钠的铂电极上,这可以通过记录循环伏安法来研究,改性电极在碱性溶液中电氧化乳酸钠的活性比要氧化大量铂的活性高,当丙酮酸盐的浓度较高时,表明它在催化剂上优先吸附,用这种方法制丙酮酸盐在欧洲一些国家已经工业化,国内尚未开发利用。
(3)     乳酸直接催化氧化法
若直接采用Pt/C或Pd/C作催化剂氧化乳酸(盐)制丙酮酸(盐),实验表明收率和选择性都很低,为了提高产品的收率和反应的选择性可用Pb、Sn、Bi、Te、In等的化合物对催化剂进行改性,催化剂附着在活性炭上,将空气吹人乳酸钠和该种催化剂组成的混合溶液中,在45℃ 下反应2h得到65%的丙酮酸。用这种方法生产丙酮酸产率和选择性均较为理想,而且成本不高,己逐渐为国内外越来越多的企业所采纳[15]。
(4)     丙酮法
该法以丙酮作为原料,将丙酮和Se、Sn或Te的氧化物(如:SeO)在室温下混合、搅拌3h可得到70%丙酮酸。该法原料易得,而且原料价格较低(丙酮3400元/t),但由于反应副产物较多,品种不易提纯,因而大大限制了该方法的推广。
1.3.2    微生物发酵法
生物发酵法生产丙酮酸的研究起始于20世纪50年代,主要是采用代谢控制育种技术切断丙酮酸的进一步代谢途径,解除丙酮酸末端产物对限速酶的反馈调节来选育丙酮酸的高产菌株。
能直接产生丙酮酸的菌种主要有以下各属:
(1) 细菌及放线菌:不动杆菌属,裂褶菌属,肠杆菌属,肠球菌属,埃希氏菌属,假单孢菌属。
(2) 酵母菌:德巴利酵母属,假丝酵母属,酵母属,球拟酵母属[5]。
发酵法生产丙酮酸所用的菌种中最为常见的是酵母,球拟酵母属菌株。
生物发酵法生产丙酮酸具有污染小、以葡萄糖为底物、成本低等优点,是一条极有发展前景的方法,因此近年来人们把目光聚焦到发酵法生产丙酮酸的研究上。
1.4 丙酮酸的代谢途径及高产菌株选育的原理
1.4.1  代谢途径
丙酮酸的代谢途径如图1所示,从图中可看出,丙酮酸是机体代谢的中间产物,处于糖酵解途径的末端,同时它又是连接EMP途径和TCA循环的中心环节,它可经多路途径生成乙醇、乳酸、草酰乙酸、丙氨酸、缬

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