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创建时间:04-06

不同种类壳聚糖抗菌性能研究

目  录

中文摘要    I
英文摘要    II
目  录    III
1  绪论    1
1.1  壳聚糖    1
1.2  壳聚糖的主要制备方法    2
1.2.1  化学法制备壳聚糖    2
1.2.2  酶法制备壳聚糖    3
1.2.3  微生物法脱乙酰基    3
1.3  壳聚糖的抗菌性    3
1.4  壳聚糖在其他方面的应用    4
1.4.1  在食品方面的应用    5
1.4.2  在药用和医疗保健方面的应用    6
1.4.3  在工业方面的应用    6
1.5  国内外研究状况    6
2  实验部分    8
2.1  材料与主要仪器设备    8
2.1.1  原料    8
2.1.2  主要材料与试剂    8
2.1.3  主要仪器设备    8
2.2  实验内容    9
2.2.1  壳聚糖的筛选    9
2.2.2  菌种活化    11
2.2.3  培养菌种    11
2.2.4  抑菌实验    11
3  结果与讨论    13
3.1  经测定筛选出下列五种壳聚糖    13
3.2  CFU的测定及确定最适稀释度    13
3.3    抑菌圈的测定结果    14
3.4  最低抑菌浓度    17
3.5  自制壳聚糖红外分析    22
4  总结与展望    23
致谢    24
参考文献    25


1  绪论
1.1  壳聚糖
壳多糖又名甲壳素,几丁质,聚乙酰基葡糖,甲壳质,明角质等,白色或灰白色无定形半透明固体,是由N-乙酰-2-胺基-2-脱氧-D-葡萄糖以-1,4糖苷键形式连接而成的多糖,因其分子结构的不同,分为α、β、γ三种类型。壳多糖结构式如下图1所示。
 
图1
甲壳类动物如干的虾和蟹壳是甲壳素的最重要资源。虾壳中壳聚糖含量为20%,龙虾壳中含量为25%,蟹壳中含量为17%~18%,其余为35%~50%的碳酸钙,30%~40%的蛋白质。由于一年四季能捕获,原料易得,自然界中每年生物合成的甲壳素约有10亿吨左右,是仅次于纤维素的天然高分子化合物,也是地球上最丰富的有机物之一。
壳多糖上的乙酰氨基可用强碱或特定的酶脱去,成为壳聚糖。是甲壳素最重要的衍生物,外观为白色或灰白色且具有金属光泽,易溶于某些有机酸,如在1%乙酸溶液中形成透明的壳聚糖胶体溶液,是最重要的性质之一。壳聚糖含有多种官能团,极具反应活性,可进行交联、接枝、酰化、磺化、羧甲基化、烷基化、硝化、卤化、氧化、还原、络合等多种反应,生成不同的衍生物,其性质不同用途也不同。壳聚糖分子内含游离的氨基和羟基,反应活性比甲壳素要强,用途更为广泛。壳聚糖的吸湿性高于甲壳素,仅次于甘油,优于山梨醇和聚乙二醇。壳聚糖可通过螯合、离子交换作用吸附许多重金属离子、蛋白质、氨基酸、染料,对一些阴离子和农药也有吸附力。壳聚糖的主链可发生水解反应,β-(1,4-)甘链断裂,生成氨基葡萄糖。利用这一特性可制备一些难于制备的葡糖胺衍生物。壳聚糖的化学结构与纤维素非常相似,只是2位碳上的羟基被氨基所代替,作为壳多糖脱去乙酰基后的生成物壳聚糖,亦分为α-,β-,γ-三种类型[1]。结构式如下图2所示。
 
图2 
1.2  壳聚糖的主要制备方法
甲壳素经脱乙酰基反应后便得到壳聚糖。常见的壳聚糖制备法有化学法和酶法两种,目前,利用微生物培养法生成壳聚糖的研究也比较活跃。
1.2.1  化学法制备壳聚糖
通用的工艺流程如下:
虾,蟹壳--净壳--水洗(中性) --脱钙脱蛋白质--水洗(中性)--干燥 粉碎 甲壳质成品--50%氢氧化钠水洗(中性)--水洗 干燥 粉碎 壳聚糖成品
化学法中,提高碱液浓度、反应温度和反应时间均可提高脱乙酰度,但同时伴随着主链的降解,从而影响壳聚糖的黏度和相对分子质量。采用微波加热代替普通加热脱乙酰可大大缩短反应时间。采用氮气保护和间歇法进行脱乙酰化反应可明显提高壳聚糖的脱乙酰度,抑制主链分子的降解。而采用“一步法”制备壳聚糖,减少了工艺流程,缩短了生产周期。
1.2.2  酶法制备壳聚糖
利用化学法制备壳聚糖存在着许多问题,诸如:耗能高;需要使用大量的强碱,容易造成环境污染;产品分子质量分布范围宽,脱乙酰度不均匀;多糖在热碱中易降解等。如采用酶法脱乙酰,可有效避免上述问题,不仅可以避免环境污染,而且可以生产出某些用化学法不能生产的壳聚糖产品,乙酰化程度均匀、分子质量分布范围窄的壳聚糖,以及具有特定乙酰化位置的壳聚寡糖等。因此,酶法脱乙酰越来越受到关注。在酶法进行脱乙酰化的反应中,常用的酶有:甲壳素酶、壳聚糖酶、甲壳素脱乙酰酶,从其作用机制分析,甲壳素脱乙酰酶的水解作用最彻底,其效果也最好。
1.2.3  微生物法脱乙酰基
壳聚糖是真菌细胞壁的常见组成部分,目前利用微生物培养法生产壳聚糖的研究也较活跃。用微生物自身存在的甲壳素合成酶和甲壳素脱乙酰酶进行自身催化,将其细胞内容物尿苷二磷酸-L-乙酰-D-葡萄糖胺转变为壳聚糖,达到脱乙酰基的目的。与虾壳制备的壳聚糖相比,用微生物培养法制备的壳聚糖质量好,纯度高。微生物培养法制取壳聚糖有着重大的环保意义。
1.3  壳聚糖的抗菌性
壳聚糖分子内同时存在游离的氨基和羟基,具有特殊的生理活性,反应活性比甲壳质还强。尤其是在抗菌抑菌方面。壳聚糖具有良好的抗菌活性,将它作为食品防腐抗菌剂的研究具有重大意义。壳聚糖的抗菌作用固然在很大程度上受到本身纯度、脱乙酰度等的影响,但客观条件如壳聚糖浓度、溶剂的种类和浓度、pH值等因素也可能会对壳聚糖的抗菌作用产生影响。
抗菌机理有以下几种。分子量小于5000的壳聚糖可以透过细胞膜,与细胞内带负电的物质结合,使细胞的正常生理功能受到影响,如DNA相互作用,干扰DNA的复制与转录,从而发挥其抗微生物活性[2]。水溶性壳聚糖和壳寡糖主要进入胞内发挥作用,导致微生物死亡;当壳寡糖进入细菌胞膜后,推测可能有一部分被细胞质内的酶降解或细菌利用,使其抗菌浓度和抗菌活性降低,使得壳寡糖较壳聚糖抗菌活性略低。但如果壳寡糖的分子量小到一定范围时,其不仅对细菌没有抑制作用,相反还有促进作用;大分子的壳聚糖吸附在微生物细胞表面,形成一层高分子膜,阻止了营养物质向细胞内运输,从而起到杀菌和抑菌作用;壳聚糖的正电荷与微生物细胞膜表面的负电荷之间的相互作用,改变了微生物细胞膜的通透性,引起微生物细胞死亡;壳聚糖作为一种螯合剂,选择性地螫合对微生物生长起关键作用的金属离子,从而抑制微生物的生长;壳聚糖能够激活微生物本身的几丁质酶活性,当壳聚糖浓度足够高时,微生物的几丁质酶被过分表达,导致对其自身细胞壁几丁质的降解,从而损伤细胞壁。
壳聚糖在乙酸溶液中氨基带有正电荷,金黄色葡萄球的细胞壁中磷壁酸所带的负电荷可提高细胞周围Mg离子的浓度,保证细胞膜上一些需要Mg离子的合成酶提高活性。大肠杆菌的细胞壁最外层是一层较厚的脂多糖,有吸附Mg、Ca 等阳离子以达到提高这些离子在细胞表面的浓度的作用,如果用螯合剂去除Ca离子和降低离子键强度,就会使脂多糖解体,这时其内壁层的肽聚糖分子就会暴露出来,因而易被溶菌酶水解。本文所用壳聚糖分子量较大,不能进入细菌细胞内部,其抗菌作用可能是上述抗菌机理第二、三、四种情况共同作用的结果。
甲壳素的脱乙酰化过程是其分子链上的乙酰胺基(-NHCOCH)转变为胺基(-NH )的过程[3]。脱乙酰化度即含-NH分子链节所占的比例,因此随着脱乙酰化度的提高,分子链中-NH含量增大,其抗菌性增强。
壳聚糖相对分子质量对其抗菌性的影响趋势也体现为对抗菌因子的影响。壳聚糖在溶液中呈无规线团状,随着相对分子质量的增加,其分子链柔韧性和卷曲程度增加,同时端基比例减少,使得壳聚糖内有效抗菌因子-NH也略有增多,从而使壳聚糖对细菌的吸附和絮凝能力增强,体现为抗菌性随相对分子质量的增加而增强;随着相对分子质量的进一步增大,壳聚糖分子链的卷曲和缠结程度增加,从而引起部分抗菌因子被包埋在大分子的无规线团中,影响了其对细菌的吸附及与带负电荷的细菌反应的能力,体现为抗菌性随着相对分子质量的增加而降低。
1.4  壳聚糖在其他方面的应用
壳聚糖被广泛应用于食品、纺织、医药、印染、废水处理、环境保护、化妆品、日用化工等领域。壳聚糖安全、无毒、成膜抑菌,可食用,可降解等多种特性,使其在食品工业中具有很大的开发和推广潜力。
1.4.1  在食品方面的应用
(1)作为果蔬保鲜剂
利用壳聚糖及其衍生物具有成膜性的特点,将其稀酸溶液或其衍生物的水溶液喷涂在果蔬或鲜肉制品的表面,形成膜保护层

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