积雪草苷提取纯化工艺研究

摘 要：本文首先建立了HPLC法测定积雪草苷提取物中积雪草苷含量的方法，采用Diamonsil C18柱，乙腈-水（50:50，v/v）为流动相，检测波长 200nm，结果积雪草苷加标回收率为 100.42℅，RSD为 1.44℅。此方法简单、准确，适用于积雪草苷提取物的质量控制。然后对积雪草有效成分积雪草苷的提取纯化工艺进行了研究。以积雪草苷含量为评价指标，采用 L9(33)正交试验优选积雪草苷提取工艺，考察了乙醇浓度、料液比、提取时间对积雪草苷含量的影响，最佳工艺为 60℅ 乙醇料液比 1：15回流提取 2h。减压回收乙醇，得积雪草苷醇提部分。加适量水溶解，以石油醚-乙酸乙酯-正丁醇溶剂系统萃取，正丁醇部分减压蒸干，溶于少量甲醇，然后滴加丙酮，析出积雪草苷粗品；并与另一条路线：氯仿-正丁醇溶剂系统萃取，正丁醇部分减压蒸干得积雪草苷粗品进行回收率和含量的比较，得到较优提纯工艺。最后采用薄层色谱法对积雪草苷粗品进行检测，摸索不同展开剂及其配比对积雪草苷粗品的分离情况，以氯仿-甲醇-水（60: 15: 10）及正丁醇-乙酸乙酯-水（4：1：5）的分离效果最好，可为后续进一步的纯化提供依据。
关键词：积雪草苷；提取；分离；纯化
 
Asiaticoside process of extraction and purification
from Centella asiatica (L.) Urb
Abstract: First of all, in this essay established a HPLC method asiaticoside extract content asiaticoside method.Using Diamonsil C18 reserved-phase column, mobile phase as acetonitrile-water （50:50，v/v）elution, detect wavelength at 200nm. The average recovery of asiaticoside is100.42 %, and RSD is 1.44%. This method is simple, accurate and applicable to extract asiaticoside quality control. And then the active ingredients of Centella asiatica asiaticoside the extraction and purification process were studied. Asiaticoside in content for evaluation,To use of L9 (33) orthogonal test asiaticoside preferred extraction process to inspect the ethanol concentration, liquid ratio, extraction time asiaticoside content, the best technology for liquid ethanol 60 ℅ return than 1:15 Extraction of  2h. Decompression ethanol recovery may asiaticoside ethanolic part. Add appropriate amount of water dissolved in petroleum ether - ethyl acetate - n-butanol solvent extraction systems, dry vacuum parts n-butanol, dissolved in a small amount of methanol, and then dropwise acetone, precipitated crude asiaticoside; and another route: chloroform - n-butanol solvent extraction system, vacuum dry n-butanol part of a crude asiaticoside to compare the recovery rate and the content, the better purification process. Finally, the use of thin-layer chromatography of crude asiaticoside test, carried out to explore the different agents and their ratio on asiaticoside separation of crude to chloroform - methanol - water (60: 15: 10) and is butanol - ethyl acetate - water (4:1:5) the best separation for the follow-up to provide a basis for further purification.
Keywords：Asiaticoside; extraction; separation; purification
 

目  录
中文摘要    II
英文摘要    III
目录    IV
1. 绪论    1
1.1 积雪草苷的理化性质与结构    1
1.2 积雪草苷的药理作用    2
1.3 积雪草苷提取纯化工艺的研究    3
1.4 积雪草苷分析方法的研究    4
2. 实验部分    5
2.1 实验材料和仪器    5
2.2 积雪草苷的 HPLC方法建立    6
2.3 正交试验提取工艺设计    10
2.4 积雪草苷的分离纯化    12
2.5 薄层色谱法鉴别积雪草苷粗品    14
3. 结果与讨论    16
3.1 积雪草苷提取工艺的结果与讨论    16
3.2 积雪草苷纯化工艺路线的结果与讨论    19
3.3 薄层色谱展开剂优化实验结果与讨论    20
4．总结与展望    23
致谢    24
参考文献    25
 
1 绪论
积雪草(Centella asiatica L Urban.)为伞形科积雪草属植物如图1.1，主要分布于我国长江流域以南各省，国外印度、斯里兰卡、马达加斯加等地也有分布，为我国传统中药，是《中国药典》收载的常用中药。始载于《神农本草经》，列为中品，具有清热利湿、解毒消肿的功效。据《本草纲目》记载积雪草其味苦，性寒，无毒。主治由热引起的恶疮，痈疽，全身皮肤发红、发热。捣成汁服，主治高热，小儿热病。单用可治颈淋巴结核及溃烂、寒热交替的驰张热。捣烂外敷，可治热肿丹毒，皮肤肿毒，并且可治风疹疥癣。治风气攻胸，做成汤来喝，立即见效。研成汁点红眼病也好。积雪草开花期在农历夏季五月份，相当与公历七月份左右。其最佳采收期在夏末秋初八九月份或秋后。积雪草可作为菜使用，亦可作为凉茶饮用[1]，可用作补药，泻药，变质剂和解热，最有名的报道是长期使用植物的叶子可以改善记忆[2]。
积雪草的化学成分包括三萜类、多炔烯类、挥发油类等多种成分。其植物的活性成分是积雪草酸，积雪草皂苷，羟基积雪草酸，羟基积雪草苷，脂肪油，谷甾醇，单宁酸，一个树脂物质，积雪草碱(生物碱)，维拉林果胶酸，抗坏血酸，两个皂苷- 玻热模甙和玻热米甙 ，三萜酸-玻热米酸，异玻热米酸和白桦酯酸和豆甾醇等[2]。其中积雪草苷（Asiaticoside,AT）以其药理活性丰富，临床作用广泛，成为积雪草中的主要活性成分。近年来，对积雪草苷开展了大量的研究证实，其显现有在心血管、免疫调节、皮肤科抗病毒等多种药理活性，因此其应用前景大，极具有开发价值。
1.1 积雪草苷的理化性质与结构
积雪草苷的分子式：C48H78O19，分子量为959.12。性状为白色针晶，熔点在230-232℃；极性较大易溶于甲醇、乙醇、水。不溶于石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮。为乌苏烷型三萜皂苷类化合物，有A、B、C、D、E五环，其中A/B、D/E环以反式骈合，B/C、C/D以顺式骈合；C10、C8、C14有CH3取代，C17为 2 分子葡萄糖、1 分子鼠李糖和COOH形成的酯苷键，C4为偕二CH ；C3为β-OH；C19为β-CH ，C20为α-CH 。结构式如图1-1所示[5]。
 
图1-1积雪草苷结构式
1.2 积雪草苷的药理作用
1.2.1 抗肿瘤
研究发现积雪草苷能抑制肿瘤细胞异常增生，并且协同增长长春新碱等抗肿瘤药物的活性；诱导癌细胞凋亡发挥抗肿瘤作用，积雪草苷能够降低人体黑色素细胞SK-MEL-2成活力，能在特定时期和特定计量下诱导其凋亡。
1.2.2 抗静脉机能不全
慢性静脉功能不全（CVI）是静脉血流量不足导致的常见疾病，通常发生在下肢，可引起多种不适，如下肢疼痛、瘙痒、疲劳且患者还经常伴有浮肿和溃疡。积雪草苷对慢性静脉功能不全有明显的治疗效果。口服给予积雪草苷还能改善微循环，疏通毛细血管，降低血管紧张度，强化血管周围结缔组织，延长发病时间，缓解疼痛以及减少静脉曲张和痔疮的合并症。研究证实，积雪草苷改善微循环的作用有利于缓解慢性静脉高血压，而且治疗作用明显[3]。
1.2.3 抗溃疡作用
积雪草苷能通过加强胃黏膜屏障作用以及降低自由基损伤效应来防治胃溃疡。中国和印度广泛在临床上应用积雪草苷于胃溃疡治疗，具有很广阔的现实意义[3]。
1.2.4 心血管方面作用
其在缺血-再灌注引发的心肌梗塞模型中具有心脑血管的保护性作用，在临床救治中将发挥极大的作用[3]。

1.2.5 促进伤口愈合皮肤修复
积雪草苷对人体皮肤角质形成细胞（HSKa）和成纤维细胞（HSFb）有明显促进增殖和促进DNA合成作用，并且能抑制瘢痕增生作用[4]。
1.2.6 其他药理作用
①抗抑郁作用：积雪草苷作为积雪草中最主要的抗焦虑抗抑郁活性物质。②恢复神经功能：积雪草苷口服可以加速神经再生，有体外增加轴突伸长的作用。③免疫调节功能：积雪草苷可以显著增加吞噬细胞指数和白细胞数目，呈现剂量依赖性。④抗炎作用：积雪草苷主要通过抑制肿瘤坏死因子，从而显著性降低巨噬细胞所产生的一氧化氮，以致炎症的恶化，促进组织细胞形态的改善以及器官修复。此外积雪草苷还具有益智、抗癫痫、抗阿尔海默氏并等多方面药理作用[3]。
1.3 积雪草苷提取纯化工艺的研究
近年来，国内为对三萜皂苷类成分的研究日趋深入，其提取工艺文献研究报道较多，主要有煎煮法、浸渍法、渗漉法、超声法和回流法等[5]。现有积雪草提取工艺多采用正交试验设计，以积雪草提取物为提取目标，针对积雪草苷单一成分的提取工艺报道较少，可参考积雪草总苷提取，再通过分离纯化得到积雪苷。积雪草苷系三萜皂苷类化合物，宜采用沸点较低的溶剂系统进行提取如甲醇[2]、乙醇等极性溶剂，从经济环保等角度考虑本文采用乙醇提取。
皂苷传统的精制与分离方法有溶剂萃取法、醇-醚沉淀、铅沉淀法、吸附法、色谱分离法。因积雪草苷是水溶性物质，根据根据积雪草苷的理化性质，对粗提物采取石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次分步萃取的方法，使积雪草苷集中在正丁醇溶解部分，因而达到去除浸膏中的脂溶性成分、挥发油及其它杂质成分的目的，即可得到积雪草苷含量较为集中的粗提物[5]。经过萃取分离后的积雪草苷粗提物纯度仍不能达到要求，因此进一步纯化是及其必要的。采用硅胶层析柱再次分离纯化的方法，能得到纯度较高的、能满足研究需要的积雪草苷成品。
本文通过两条分离纯化路线：石油醚-乙酸乙酯-正丁醇溶剂系统萃取；以及另一条路线氯仿-正丁醇溶剂系统萃取。并对这两条路线所得积雪草苷出品进行含量和提取率的比较。